การเจาะหลอดเลือดดำ (อังกฤษ: venepuncture, venopuncture, venipuncture) เป็นหัตถการทางการแพทย์อย่างหนึ่งซึ่งทำเพื่อทำให้มีทางเชื่อมเข้าสู่หลอดเลือด โดยมีจุดประสงค์เพื่อให้การรักษาเข้าหลอดเลือด (intravenous therapy) หรือเก็บตัวอย่างเลือดดำ ผู้ทำหัตถการจะเป็นนักเทคนิคการแพทย์ บุคลากรทางการแพทย์ นักเทคนิคการแพทย์ฉุกเฉิน (emergency medical technician) หน่วยกู้ชีพ (paramedic) นักเจาะเลือด (phlebotomist) และบุคลากรทางการพยาบาลอื่นๆส่วนใหญ่จะเจาะเลือดที่หลอดเลือดดำ median cubital ที่ข้อพับแขน หลอดเลือดดำเส้นนี้อยู่ในตำแหน่งใกล้ผิวหนัง และไม่มีเส้นประสาทขนาดใหญ่อยู่คู่กัน