มหาวิทยาลัยมหิดล มีความเป็นมาจากโรงศิริราชพยาบาล ซึ่งพระบาทสมเด็จพระปรมินทรมหาจุฬาลงกรณ์ พระจุลจอมเกล้าเจ้าอยู่หัวทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้จัดสร้างขึ้นบริเวณพระราชวังบวรสถานพิมุข หรือที่เรียกว่า วังหลัง[12] ต่อมาในปี พ.ศ. 2432 จึงมีพระบรมราชานุญาตให้จัดตั้งโรงเรียนแพทย์ ณ โรงศิริราชพยาบาล และตั้งชื่อโรงเรียนแพทย์ว่า "โรงเรียนแพทยากร"[13] จัดการเรียนการสอนในระดับประกาศนียบัตร 3 ปี หลังจากนั้น เมื่อพระบาทสมเด็จพระจุลจอมเกล้าเจ้าอยู่หัว พร้อมด้วยสมเด็จพระนางเจ้าเสาวภาผ่องศรี พระบรมราชินีนาถ เสด็จพระราชดำเนินเปิดตึกของโรงเรียนแพทย์ จึงได้พระราชทานนามโรงเรียนแพทยากรใหม่ว่า "โรงเรียนราชแพทยาลัย"ในรัชสมัยพระบาทสมเด็จพระมงกุฏเกล้าเจ้าอยู่หัว ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ สถาปนาโรงเรียนข้าราชการพลเรือนของพระบาทสมเด็จพระจุลจอมเกล้าเจ้าอยู่หัวขึ้นเป็น "จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย" จึงได้รวมโรงเรียนราชแพทยาลัยเข้าเป็นคณะหนึ่งของจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ตั้งแต่วันที่ 6 เมษายน พ.ศ. 2460[14] โดยใช้ชื่อว่า "คณะแพทยศาสตร์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย" ต่อมา จึงเปลี่ยนชื่อเป็น "คณะแพทยศาสตร์และศิริราชพยาบาล"

เมื่อวันที่ 2 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2486 คณะผู้สำเร็จราชการแทนพระองค์ในพระปรมาภิไธยสมเด็จพระเจ้าอยู่หัวอานันทมหิดล มีพระบรมราชโองการให้ตราพระราชบัญญัติมหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์ขึ้น โดยที่สภาผู้แทนราษฎรลงมติว่า สมควรกำหนดฐานะระเบียบแบบแผนสำหรับการศึกษาในกรมมหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์ กระทรวงการสาธารณสุข โดยแยก คณะแพทยศาสตร์และศิริราชพยาบาล แผนกอิสระทันตแพทยศาสตร์ แผนกอิสระเภสัชศาสตร์ และแผนกอิสระสัตวแพทยศาสตร์ จากจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย จัดตั้งเป็น "มหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์"[15] สังกัดกระทรวงการสาธารณสุข โดยได้จัดตั้งคณะต่าง ๆ ในมหาวิทยาลัยมากมาย เช่น คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลจุฬาลงกรณ์ คณะสาธารณสุขศาสตร์ คณะเทคนิคการแพทย์ คณะวิทยาศาสตร์การแพทย์ คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลนครเชียงใหม่ คณะอายุรศาสตร์เขตร้อน บัณฑิตวิทยาลัย คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี คณะทันตแพทยศาสตร์ พญาไท และคณะเภสัชศาสตร์ พญาไท ตามลำดับ ต่อมาได้มีการปฏิรูปครั้งใหญ่ โดยการโอนคืนคณะที่ซ้ำซ้อนต่าง ๆ ออกจากมหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์ ได้แก่ คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลจุฬาลงกรณ์ ไปเป็น คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลนครเชียงใหม่ ไปเป็น คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ คณะสัตวแพทยศาสตร์ ไปเป็น คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ คณะเภสัชศาสตร์ และคณะทันตแพทยศาสตร์ โอนไปสังกัดจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

เมื่อวันที่ 21 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2512 พระบาทสมเด็จพระปรมินทรมหาภูมิพลอดุลยเดช มีพระบรมราชโองการโปรดเกล้าฯ ให้ประกาศว่า โดยที่เป็นการสมควรปรับปรุงมหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์ ให้เป็นมหาวิทยาลัยที่สมบูรณ์แบบ และทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ พระราชทานนามมหาวิทยาลัยว่า มหาวิทยาลัยมหิดล อันเป็นพระนามของสมเด็จพระมหิตลาธิเบศร อดุลยเดชวิกรม พระบรมราชชนก แทนชื่อมหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์เดิม[16]

เมื่อวันที่ 16 ตุลาคม พ.ศ. 2550 พระบาทสมเด็จพระปรมินทรมหาภูมิพลอดุลยเดช มีพระบรมราชโองการโปรดเกล้าฯ ให้ประกาศว่า โดยที่เป็นการสมควรปรับปรุงกฎหมายว่าด้วยมหาวิทยาลัยมหิดล[17] เป็นผลทำให้มหาวิทยาลัยได้เปลี่ยนรูปแบบการบริหารงานเป็นมหาวิทยาลัยในกำกับของรัฐ

ปัจจุบันมหาวิทยาลัยมหิดลจัดการเรียนการสอนภายในคณะ วิทยาลัย สถาบัน และหน่วยงานต่าง ๆ ครอบคลุมทั้งในสาขาวิทยาศาสตร์สุขภาพ วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี สังคมศาสตร์และมนุษยศาสตร์