พระราชประวัติของสมเด็จพระนเรศวรมหาราชส่วนใหญ่ได้จากพงศาวดารอยุธยา ซึ่งมักมีการจดบันทึกในพระราชกรณียกิจ ซึ่งส่วนใหญ่บันทึกถึงการทำสงครามกับอาณาจักรเพื่อนบ้านเป็นอันมาก จนมองข้ามเกี่ยวกับเจ้านายฝ่ายในหรือพระมเหสีของพระองค์ อย่างไรก็ตามได้มีการปรากฏพระนามของเจ้านายฝ่ายใน ในเอกสารของต่างชาติ 5 ฉบับด้วยกัน ซึ่งได้แก่ จดหมายเหตุสเปน (History of the Philippines and Other Kingdom) ของบาทหลวงมาร์เชโล เด ริบาเดเนย์รา (Marchelo de Ribadeneira, O.F.M), จดหมายเหตุวันวลิต, พงศาวดารละแวก, คำให้การขุนหลวงหาวัด และมหาราชวงศ์ ฉบับหอแก้ว ซึ่งปรากฏพระนามพระมเหสี 3-4 พระองค์ โดยมีพระนามดังนี้[39]

1. พระมณีรัตนา หรือ เจ้าขรัวมณีจันทร์ จากจดหมายเหตุวันวลิต
2. โยเดียมี้พระยา พระราชธิดาในพระเจ้านรธาเมงสอกับพระนางเชงพยูเชงเมดอ[40] ปฐมวงศ์พม่าที่ปกครองอาณาจักรล้านนา จากพงศาวดารพม่า
3. พระเอกกษัตรีย์ พระราชธิดาในพระเจ้าศรีสุพรรณมาธิราช เจ้าแผ่นดินเขมร จากพงศาวดารเขมร

มีการกล่าวถึง พระมณีรัตนา และเจ้าขรัวมณีจันทร์ ว่าอาจเป็นบุคคลเดียวกัน แต่บ้างก็ว่าอาจเป็นคนละคนกัน โดยเชื่อว่า พระมณีรัตนาอาจเป็นเจ้าหญิงที่สืบเชื้อสายมาจากราชวงศ์ละโว้สายสุพรรณภูมิของสมเด็จพระมหาจักรพรรดิและสมเด็จพระมหินทราธิราช[41] ซึ่งในขณะนั้นเจ้านายฝ่ายในในสมัยสมเด็จพระมหาจักรพรรดิ พระองค์หนึ่งมีพระนามว่า พระรัตนมณีเนตร หรือ พระแก้วฟ้า ซึ่งเป็นพระขนิษฐาต่างชนนีของพระวิสุทธิกษัตรีย์ ซึ่งหากเป็นเช่นนั้นพระนางจะมีศักดิ์เป็นพระมาตุจฉาของพระนเรศวร[42] อย่างไรก็ตามเจ้าขรัวมณีจันทร์ มีบทบาทสูงกว่าพระมเหสีจากเชียงใหม่และเขมร[43] โดยมีการสถาปนาพระนางเป็นอัครมเหสีดังที่ปรากฏในคำให้การขุนหลวงหาวัดที่กล่าวถึงเมื่อครั้งที่สมเด็จพระนเรศวรมหาราชเสด็จขึ้นเสวยราชย์สมบัติต่อจากพระราชบิดา ความว่า

หลังจากการสวรรคตของสมเด็จพระนเรศวรมหาราช และสมเด็จพระเอกาทศรถได้เสด็จขึ้นครองราชย์ต่อนั้น เจ้าขรัวมณีจันทร์ได้ปรากฏอีกครั้งในจดหมายเหตุวันวลิต ที่ได้กล่าวถึง พระชายาม่ายของสมเด็จพระนเรศวร ได้เสด็จออกบวชชี และเป็นเหตุให้บุคคลทั่วไปเรียกกันว่า เจ้าขรัว จนกระทั่งมีเหตุการณ์หนึ่งที่เสด็จไปช่วยพระราชโอรสพระองค์หนึ่งของสมเด็จพระเอกาทศรถ คือ "เจ้าไล" หรือศรี ซึ่งมีเหตุวิวาทกับพระยาออกนา จนต้องพระราชอาญาจนถึงชีวิต ข้ารองพระบาทในพระองค์ไลจึงได้ไปทูลขอพึ่งพระบารมีเจ้าขรัวมณีจันทร์ซึ่งเป็นพระปิตุจฉา พระนางจึงรีบเสด็จเข้าเฝ้าสมเด็จพระเอกาทศรถ จนสมเด็จพระเอกาทศรถยินยอมด้วยความเกรงพระทัย (แต่ในจดหมายเหตุวันวลิตกล่าวว่า ถูกฟันด้วยพระแสงดาบและถูกจำคุกเป็นเวลา 5 เดือน เจ้าขรัวมณีจันทร์จึงได้ขอพระราชทานอภัยโทษ)[44] โดยปรากฏในจดหมายเหตุวันวลิต ความว่า "จนกระทั่งเจ้าขรัวมณีจันทร์ ชายาม่ายของพระเจ้าอยู่หัวในพระโกศ คือ พระ Marit หรือพระองค์ดำ ได้ทูลขอจึงเป็นที่โปรดปรานอีก"[45]

พระราชโอรส-ธิดา

มีการกล่าวถึงพระราชโอรสในสมเด็จพระนเรศวรมหาราชในจดหมายเหตุสเปน (History of the Philippines and Other Kingdom) ของบาทหลวงมาร์เชโล เด ริบาเดเนย์รา (Marchelo de Ribadeneira, O.F.M) ที่เขียนขึ้นจากคำบอกเล่าของบาทหลวงคณะฟรันซิสกันที่เคยพำนักอยู่ในกรุงศรีอยุธยาใน พ.ศ. 2125 ปลายรัชสมัยสมเด็จพระมหาธรรมราชาธิราช และ พ.ศ. 2139 ตรงกับต้นรัชสมัยของสมเด็จพระนเรศวรมหาราช โดยเนื้อความในจดหมายเหตุนี้ได้มีการอธิบายถึงกระบวนพยุหยาตราชลมารคของพระเจ้าแผ่นดินสยาม โดยมีเนื้อความตอนหนึ่งที่ได้กล่าวถึงพระอัครมเหสีและพระราชโอรสผู้ทรงพระเยาว์โดยเสด็จด้วย ความว่า[46]

เมื่อนำเหตุการณ์ที่บาทหลวงสเปนได้เขียนบอกเล่าไว้ไปเทียบเคียงกับพระราชพงศาวดารกรุงศรีอยุธยา ฉบับพระจักรพรรดิพงศ์ (จาด) จะพบว่าในรัชสมัยของสมเด็จพระนเรศวรมหาราชได้มีการกล่าวถึงพระราชพิธีอาสวยุทธ และการต้อนรับคณะทูตกัมพูชาที่เดินทางมาถวายเครื่องราชบรรณาการยังราชสำนักอยุธยาซึ่งตรงกับเหตุการณ์การเสด็จฯทางชลมารคและการออกรับทูตกัมพูชาในจดหมายเหตุของสเปน[47] โดยบางทีสมเด็จพระนเรศวรมหาราชอาจมีพระราชโอรสมากกว่า 1 พระองค์แล้ว เนื่องจากในจดหมายเหตุมีการใช้คำว่า "พระราชกุมารพระองค์เยาว์ที่สุด"

นอกจากนี้สมเด็จพระนเรศวรมหาราชก็มีพระราชธิดาด้วย โดยกล่าวถึงพระเจ้าเชียงใหม่นรธาเมงสอได้รับการช่วยเหลือจากกรุงศรีอยุธยาเพื่อจัดการปัญหาเมืองขึ้นแข็งเมือง และช่วยป้องกับการรุกรานข้าศึก ด้วยการเกื้อกูลกันดังกล่าว ได้สร้างสายสัมพันธ์ทางเครือญาติกับนรธามังสอและสมเด็จพระนเรศวรมหาราช โดยสมเด็จพระนเรศวรมหาราชได้ทรงยกพระราชธิดาให้สมรสกับเมงสาตุลอง[48][49]ผู้ซึ่งเป็นพระราชโอรสในพระเจ้านรธามังสอ โดยพระเจ้านรธามังสอก็ได้ถวายพระราชธิดาให้เป็นพระมเหสีของสมเด็จพระนเรศวรมหาราชด้วย[50] โดยการมอบพระราชธิดาของพระเจ้านรธามังสอแด่สมเด็จพระนเรศวรมหาราช มีปรากฏในโคลงบทที่ 21 ความว่า

อย่างไรก็ตามก็มีหลักฐานเกี่ยวกับพระอัครมเหสีรวมไปถึงพระราชโอรสและพระราชธิดาน้อยมาก เนื่องจากผู้ที่เขียนจดหมายเหตุสเปนเองก็บันทึกจากผู้เห็นเหตุการณ์ที่ไม่รู้รายละเอียด รวมไปถึงพงศาวดารของพม่าที่กล่าวถึงพระราชธิดาในสมเด็จพระนเรศวรมหาราชอย่างผ่าน ๆ เท่านั้น[52] ภายหลังจากที่สมเด็จพระนเรศวรมหาราชเสด็จสวรรคตแล้ว ราชสมบัติจึงตกแก่สมเด็จพระเอกาทศรถ[53]