หูชั้นกลาง (อังกฤษ: middle ear, auris media) คือหูส่วนที่อยู่หลังแก้วหู แต่ก่อนช่องรูปไข่ (oval window) ของหูชั้นในในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม หูชั้นกลางจะมีกระดูกหู (ossicles) เล็ก ๆ 3 ท่อน ซึ่งถ่ายโอนแรงสั่นที่แก้วหูไปเป็นคลื่นภายในหูชั้นในช่องในหูชั้นกลางเรียกว่า โพรงหูส่วนกลาง (tympanic cavity)โดยมีท่อยูสเตเชียน เชื่อมกับคอหอยส่วนจมูก (nasopharynx) ท่อยูสเตเชียนจะช่วยรักษาดุลความดันระหว่างหูชั้นกลางและคอหน้าที่หลักของหูชั้นกลางก็คือถ่ายโอนพลังงานเสียงจากคลื่นในอากาศไปเป็นคลื่นในน้ำและในเยื่อของหูชั้นในรูปหอยโข่ง (Cochlea)