การสังเคราะห์ cDNA มีหลายวิธี แต่การสังเคราะห์ cDNA นั้น มักจะสังเคราะห์ขึ้นจาก mature mRNA (RNA ที่ intron ถูกตัดออกไปแล้ว) โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase ซึ่งจะทำงานบนอาร์เอ็นเอสายเดี่ยว (single strand of mRNA) ในการสร้างสายดีเอ็นเอที่จำเพาะกับอาร์เอ็นเอนั้น (complementary DNA) โดยจะอาศัยการจับกันของเบสของอาร์เอ็นเอ (A, U, G และ C) กับเบสของดีเอ็นเอที่จับกันนั้น (T, A, C และ G ตามลำดับ) โดยมีหลักการคร่าว ๆ ดังนี้

1. ยูคาริโอตเซลล์จะถอดรหัสของยีนจากดีเอ็นเอไปเป็นอาร์เอ็นเอ (pre-mRNA)
2. pre-mRNA นั้นจะถูกกำจัด intron, เพิ่ม poly-A tail และ 5’ Methyl-Guanine cap หลังจากสิ้นสุดกระบวนการนี้จะเรียกว่า mature mRNA
3. mature mRNA จะถูกสกัดออกมาจากเซลล์
4. poly-T oligonucleotide primer จะจับกับ poly-A tail ของ mature mRNA ซึ่งใช้เป็นต้นแบบในการสังเคราะห์ cDNA หรือ อาจจะใช้ random hexamer primer ซึ่งสามารถจับกับ RNA ได้เช่นกัน
5. เติม Reverse transcriptase ร่วมกับ deoxynucleoside triphosphate (A, T, G, C) ขั้นตอนนี้จะสังเคราะห์ดีเอ็นเอหนึ่งสายโดยใช้ mRNA เป็นต้นแบบ (DNA-RNA hybrid strand)
6. ในการสร้างสายดีเอ็นเออีกสายเพื่อสร้าง double strand DNA (dsDNA) ต้องทำการย่อยสาย RNA ที่จับกับดีเอ็น (DNA-RNA hybrid) ในขั้นตอนก่อนหน้าโดยใช้เอนไซม์ เช่น RNase A
7. หลังจากย่อยสายอาร์อ็นเอแล้ว ดีเอ็นเอจะกลายเป็นสายเดี่ยว (single stranded cDNA:ss cDNA) ดีเอ็นเอจะเปลี่ยนรูปร่างเป็น loop เนื่องจากภาวะ hydrophobic
8. จากการที่ ss cDNA มีลักษณะเป็น loop นั้นจึงสามารถใช้เป็นต้นแบบในการสร้างสายดีเอ็นเออีกเส้นโดยใช้ reverse transcriptase
9. เมื่อถึงขั้นตอนนี้จะได้ double stranded cDNA ซึ่งจะมีลำดับเบสที่เหมือนกับ mRNA ที่ต้องการ