โลคัสพันธุกรรมคริสเปอร์ทำให้แบคทีเรียมีกลไกลการป้องกันตัวจากการติดเชื้อเฟจซ้ำอาร์เอ็นเอจากดีเอ็นเอของโลคัสพันธุกรรมคริสเปอร์และการเติบโตของ pre-crRNAรูปร่างสามมิติของ CRISPR-Cas9 Interference Complexขั้นตอนของภูมิคุ้มกันคริสเปอร์สำหรับสามรูปแบบหลักของภูมิคุ้มกันแบบจำเพาะ หรือ adaptive immunity (1) การได้มาเริ่มจากการรู้จำของดีเอ็นเอบุกรุกโดย Cas1 และ Cas2 และการตัดของโปรโตสเปสเซอร์ (2) โปรโตสเปสเซอร์ถูกเชื่อมกับลำดับซ้ำโดยตรงติดกับลำดับนำ และ (3) การซ่อมแซมเพิ่มความยาวสายเดี่ยว (single strand extension repair) และการทำสำเนาลำดับซ้ำโดยตรง การแปรรูป crRNA และขั้นตอนการเข้าแทรกแซงเกิดขึ้นต่างกันในทั้งสามระบบหลักของคริสเปอร์ (4) สายอาร์เอ็นเอหลักถูกตัดโดยยีนแคสเพื่อสร้าง crRNA (5) ในระบบแบบที่ 1 Cas6e/Cas6f ตัดในจุดต่อของอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวและสายคู่ สร้างเป็นห่วงในลำดับซ้ำโดยตรง ระบบแบบที่ 2 ใช้ trans-activating (tracr) อาร์เอ็นเอเพื่อสร้างอาร์เอ็นเอสายคู่ ซึ่งถูกตัดโดย Cas9 และ RNaseIII ระบบแบบที่ 3 ใช้คู่เหมือน Cas6 ที่ไม่ต้องการห่วงในลำดับซ้ำโดยตรงเพื่อตัด (6) ในระบบแบบที่ 2 และ 3 เกิดการตัดทุติยภูมิขึ้นที่ด้านท้าย 5’ หรือ 3’ เพื่อสร้าง crRNAs ที่สมบูรณ์ (7) crRNAs สมบูรณ์จับกับโปรตีนแคสเพื่อสร้างเป็นกลุ่มรวมเพื่อแทรกแซง (8) ในระบบแบบที่ 1 และ 2 จำเป็นต้องมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนและลำดับแพมเพื่อที่จะทำให้เกิดการทำลายดีเอ็นเอที่บุกรุกอย่างเป็นผลสำเร็จ ระบบแบบที่ 3 ไม่ต้องการลำดับแพมเพื่อทำลาย และในระบบเอของแบบที่ 3 มีการจับคู่กันระหว่าง crRNA และ mRNA แทนที่จะเป็นดีเอ็นเอที่เป็นเป้าของระบบ B ของแบบที่ 3

ภูมิคุ้มกันคริสเปอร์-แคสเป็นกระบวนการทางธรรมชาติของแบคทีเรียและอาร์เคีย คริสเปอร์-แคสป้องกันการติดเชื้อเฟจ, คอนจูเกชัน (conjugation) และการแปลงพันธุ์ทางธรรมชาติ โดยการทำลายกรดนิวคลีอิกจากภายนอกที่เข้ามาในเซลล์[19]

การได้มาซึ่งสเปสเซอร์

เมื่อจุลินทรีย์ถูกบุกรุกโดยไวรัส ขั้นแรกของการตอบสนองของภูมิคุ้มกันคือการจับดีเอ็นเอของไวรัสและใส่เข้าไปในโลคัสคริสเปอร์ในรูปแบบของสเปสเซอร์ การที่ Cas1 และ Cas2 อยู่ในระบบภูมิคุ้มกันคริสเปอร์-แคสทั้งสองแบบ ชี้ว่าพวกมันมีส่วนในการได้มาซึ่งสเปสเซอร์ งานวิจัยการกลายพันธุ์ยืนยันสมมติฐานนี้ และแสดงว่าการนำยีน cas1 หรือ cas2 ออกทำให้ไม่สามารถจัดหาสเปสเซอร์ได้ ในขณะที่ไม่ส่งผลกระทบต่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกันคริสเปอร์[20][21][22][23][24]

โปรตีน Cas1 หลายโปรตีนถูกศึกษาลักษณะเฉพาะและหาโครงสร้าง[25][26][27] โปรตีน Cas1 มีลำดับกรดอะมิโนหลากหลาย อย่างไรก็ตาม โครงสร้างผลึกมีลักษณะคล้ายกัน และโปรตีน Cas1 ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ทั้งหมดเป็นนิวคลีเอส/อินทีเกรสที่ต้องพึ่งธาตุโลหะ และจับกับดีเอ็นเอโดยไม่พึ่งกับลำดับ[28] โปรตีน Cas2 ที่ถูกเลือกได้รับการศึกษาลักษณะเฉพาะ และพบว่าพวกมันแสดงกิจกรรมเอนโดริโบนิวคลีเอสเฉพาะต่อ ssRNA (สายเดี่ยว)[29] หรือ dsDNA (สายคู่)[30][31]

ในระบบไอ-อี ของ E. coli Cas1 และ Cas 2 จับกันเป็นกลุ่มรวมโดยสองส่วน (dimer) ของ Cas2 จับเข้ากับสองส่วนของ Cas1[32] ในกลุ่มรวมนี้ Cas2 มีหน้าที่เป็นโครงสร้างแบบไม่ใช้เอนไซม์[32] และจับกับชิ้นสายคู่ของดีเอ็นเอจากภายนอก ขณะที่ Cas1 จับกับด้านข้างของดีเอ็เอส่วนสายเดี่ยวและช่วยเร่งในการรวมเข้ากับแถวลำดับคริสเปอร์[33][34][35] สเปสเซอร์ใหม่ถูกเพิ่มในส่วนเริ่มของคริสเปอร์ต่อจากลำดับนำ (leader sequence) ทำให้เป็นการบันทึกการติดเชื้อไวรัสตามลำดับเวลา[36]

โมทีฟติดกับโปรโตสเปสเซอร์

การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศศาสตร์บริเวณจีโนมเฟจที่ถูกตัดเป็นสเปสเซอร์ (เรียกว่าโปรโตสเปสเซอร์, protospacer) ชี้ว่าไม่ได้เป็นการเลือกอย่างสุ่ม ทว่าถูกพบติดกับลำดับดีเอ็นเอสั้น ๆ (3 – 5 คู่เบส) ที่เรียกว่า protospacer adjacent motifs หรือ แพม (PAM) การวิเคราะห์ของระบบคริสเปอร์-แคสแสดงว่าลำดับแพมมีความสำคัญสำหรับระบบแบบที่ 1 (type I) และแบบที่ 2 (type II) ทว่าไม่สำคัญในแบบที่ 3 (type III) ระหว่างการได้มาซึ่งสเปสเซอร์[37][38][39][40][41][42] ในระบบแบบที่ 1 และ 2 โปรโตสเปสเซอร์ถูกตัดบนตำแหน่งติดกับลำดับแพม โดยอีกด้านหนึ่งของสเปสเซอร์ถูกตัดโดย ruler mechanism ทำให้ขนาดของสเปสเซอร์ใกล้เคียงกันในแถวลำดับคริสเปอร์[43][44] การอนุรักษ์ลำดับแพมแตกต่างกันไปในคริสเปอร์-แคสแต่ละระบบและอาจเชื่อมโยงกับ Cas1 และลำดับนำ (leader sequence)[42][45]

สเปสเซอร์ใหม่ถูกเพิ่มเข้าไปในแถวลำดับคริสเปอร์โดยมีทิศทางที่แน่นอน[46] มักเลือกที่จะ[47][38][39][48][49] แต่ไม่เพียงแต่[41][44] ติดกับลำดับนำ การวิเคราห์ของระบบไอ-อีจาก E. coli แสดงว่าลำดับซ้ำแรกติดกับลำดับนำถูกคัดลอก โดยมี สเปสเซอร์ใหม่ที่พึ่งได้มาแทรกระหว่างลำดับซ้ำแรกและสอง[23][43]

ลำดับแพมน่าจะมีความสำคัญระหว่างการแทรกสเปสเซอร์ในระบบไอ-อี ลำดับนั้นมีส่วนประกอบของนิวคลีโอไทด์ท้ายที่ถูกคงไว้ติดกับนิวคลีโอไทด์แรกของโปรโตสเปสเซอร์ นิวครีโอไทด์นี้กลายเป็นเบสสุดท้ายของลำดับซ้ำโดยตรง (direct repeat) ชิ้นแรก[24][50][51] สิ่งนี้ชี้ว่ากลไกการได้มาซึ่งสเปสเซอร์ทำให้เกิดส่วนยื่นสายเดี่ยวในตำแหน่งรองท้ายของลำดับซ้ำโดยตรงและลำดับแพมระหว่างการแทรกสเปสเซอร์ อย่างไรก็ตาม ไม่ใช่ทุกแบบของคริสเปอร์-แคสจะใช้กลไกนี้ ด้วยความที่แพมในสิ่งมีชีวิตอื่นไม่แสดงการคงไว้ของตำแหน่งสุดท้ายในระดับเท่ากัน[45] เป็นไปได้ว่าระบบเหล่านี้ทำให้เกิดปลายทู่ที่ไม่มีส่วนยื่นออกมาตรงส่วนท้ายของลำดับซ้ำโดยตรงและโปรโตสเปสเซอร์ระหว่างการได้มาซี่งสเปสเซอร์