ลางสังหรณ์ถึงการถูกลอบปลงพระชนม์ของพระองค์มีมานานแล้ว พระองค์ทรงกำจัดขุนนางที่มีท่าที่เป็นปฏิปักษ์กับพระองค์ และอุปการะชุบเลี้ยงอีกทั้งยังมอบเบี้ยรางวัลแกขุนนางที่พระองค์ทรงไว้วางพระทัย นอกจากนี้พระองค์ยังทรงค้นพบถึงการกระทำเพทุบายและฉ้อราษฎบังหลวงร้ายแรงในท้องพระคลังรัสเซียด้วย อีกทั้งพระองค์ได้ทรงล้มเลิกกฎหมายของพระนางเจ้าแคทเธอรีนที่ว่าด้วยการสำเร็จโทษทางร่างกายโดยอิสระและทรงปรับเปลี่ยนใหม่อย่างสิ้นเชิงซึ่งเอื้อความชอบธรรมให้แกชนชั้นล่างมากขึ้น และทรงปรับเปลี่ยนวิธีการทำกสิกรรมของชาวรัสเซียให้ดีขึ้น ซึ่งถูกมองว่าเป็นนโยบายที่กลั่นแกล้งชนชั้นขุนนางและเป็นการชักชวนให้ผู้ซึ่งเป็นปฏิปักษ์ต่อพระองค์ล้มเลิกแผนการโค่นล้มพระองค์

กลุ่มผู้สมรู้ร่วมคิดการลอบปลงพระชนม์ได้จัดตั้งขึ้นหนึ่งเดือนก่อนการลงมือ โดยประกอบด้วย เคาท์ปิออตร์ อเล็กเซเยวิช ปาห์เลน, นิคิตา เปโตรวิช ปานิน, และพลเรือเอกโจเซ เด ริบาส โดยเป็นพลเรือลูกครึ่งสเปน-เนเปิลส์ ซึ่งการเสียชีวิตของเขาทำให้การลอบปลงชนม์ล่าช้าออกไป โดยในคืนวันที่ 23 มีนาคม (นับตามแบบเก่า: 11 มีนาคม) ค.ศ. 1801 พระจักรพรรดิพอลล์ถูกปลงพระชนม์บนแท่นพระบรรทมในห้องบรรทมใหม่เอี่ยม ณ พระตำหนักในพระราชวังเซนต์ไมเคิล โดยความร่วมมือจากการที่นายพเบนนิกเซนออกคำสั่งยกเลิกประจำการบริเวณพระตำหนักของเหล่าเจ้าหน้าที่รักษาพระองค์ ผู้ซึ่งเป็นชาวฮันโนเฟอร์ในราชสำนักรัสเซีย อีกทั้งจากความร่วมมือของนายพลยาชวิลชาวจอร์เจีย โดยพวกเขาจู่โจมเข้าไปในห้องพระบรรทม ซึ่งก่อนหน้าที่ยังทรงพระกระยาหารค่ำด้วยกันกับเหล่านายพล เหล่าผู้ก่อกบฏพบตัวพระองค์ซ่อนอยู่ในผ้าบริเวณมุมห้อง จากนั้นลากตัวพระองค์ออกมาและบังคับให้ไปยังโต๊ะทรงงาน จากนั้นบังคับให้ทรงลงพระนามในเอกสารสละราชสมบัติ แต่พระองค์ทรงขัดขืนแต่ต่อสู้ ผู้ร่วมก่อกบฏคนหนึ่งจึงแทงพระองค์ด้วยดาบ พระองค์ทรงถึงหายใจไม่ออกและทรงกล่าวเหยียดหยามต่อความตาย ราชบัลลังก์ตกมาเป็นของพระราชโอรสพระองค์ใหญ่ แกรนด์ดยุกอะเลคซันดร์ โดยนายพลนิโคลัส ซูบอฟ หนึ่งในผู้ร่วมก่อกบฏได้กล่าวแนะนำให้พระองค์ขึ้นสืบราชบัลลังก์ โดยกล่าวกับอะเลคซันดร์ว่า

ถึงเวลาที่พระองค์จะต้องทรงเติบใหญ่และเสวยราชย์เป็นจักรพรรดิแล้ว— นายพลนิโคลัส ซูบอฟ