ยา AZT เป็นยาในกลุ่ม Nucleosides Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs) มีลักษณะโครงสร้างคล้ายกับ thymidine ซึ่งเป็นหน่วยของสารพันธุกรรมในสิ่งมีชีวิต แต่จะแตกต่างกันที่โครงสร้างในตำแหน่งที่ 3 ของ AZT จะเป็น –N3 (azido group) แต่ของ thymidine จะเป็น –OH ยา AZT จะเข้าไปหยุดกระบวนเปลี่ยน RNA เป็น DNA (reverse transcription) โดยอาศัยโครงสร้างที่คล้ายกับหน่วยพันธุกรรมของมัน เข้าไปรวมตัวกับสาย DNA ที่ไวรัสสร้างขึ้น แต่เนื่องจากการมีหมู่ azido เข้ามาแทนที่ –OH ทำให้ไม่สามารถสร้างพันธะกับ nucleotide ตัวต่อไปได้ ทำให้เอนไซม์ Reverse Transcriptase ไม่สามารถนำ Nucleosides ตัวต่อไปมาเชื่อมต่อได้ ทำให้ไม่ได้ DNA ที่สมบูรณ์ กระบวนการจึงสิ้นสุดลง เมื่อ AZT เข้าสู่ร่างกายจะยังไม่สามารถออกฤทธิ์ได้ทันที จำเป็นต้องผ่านเข้าเซลล์และถูกเติมหมู่ phosphate 3 หมู่ ก่อน โดย AZT จะถูกเติม phosphate โดยเอนไซม์ thymidine kinase, thymidylate kinase, และ diphosphate kinase ตามลำดับทำให้อยู่ในรูปที่เรียกว่า AZT-triphosphate ซึ่งเป็นรูปที่ออกฤทธิ์ได้ หลังจากนั้น AZT-triphosphate จะแย่งสารพันธุกรรมธรรมชาติในการจับกับเอนไซม์ reverse transcriptase ทำให้การเชื่อมต่อสาย DNA หยุดลง