เนื้อหาและระบบของเกมในภาคนี้ ยังคงคล้ายคลึงกับ ซูเปอร์มาริโอบราเธอส์ ภาคก่อนหน้า แต่ส่วนที่แตกต่างออกไปคือ ในภาคนี้ คุปปะ ไม่ได้เข้ารุกราน นครเห็ด แต่กลับเป็นนครอื่นๆ จำนวน 7 แห่ง ซึ่งแต่ละแห่งนับเป็น 1 สเตจ โดย 2 พี่น้อง มาริโอและลุยจิ จะต้องตะลุยผ่านสเตจทั้ง 7 แห่งไปให้ถึง นครแห่งความมืด สเตจสุดท้าย ซึ่งเป็นที่มั่นของคุปป้า และช่วย เจ้าหญิงพีช ที่ถูกคุปป้าลักพาตัวไประหว่างทางกลับมาให้ได้