ณฐนนท ทวีสิน รับราชการเป็นข้าราชการกรุงเทพมหานคร เคยได้รับแต่งตั้งให้ดำรงตำแหน่งสำคัญ ได้แก่ ผู้อำนวยการกองกลาง ผู้อำนวยการกองงบประมาณ ผู้อำนวยการสำนักรักษาความสะอาด ผู้อำนวยการสำนักพัฒนาชุมชน ผู้อำนวยการสำนักนโยบายและแผนกรุงเทพมหานคร รองปลัดกรุงเทพมหานคร และตำแหน่งสุดท้าย คือ ปลัดกรุงเทพมหานคร

ในระหว่างรับราชการ ได้เป็นผู้ริเริ่มเปลี่ยนแปลงระบบงบประมาณ จากงบประมาณแบบแสดงรายงาน มาเป็นงบประมาณแบบแผนงานและวิเคราะห์งบประมาณอย่างเป็นระบบ และนำระบบคอมพิวเตอร์มาใช้ในการบริหารและติดตามงบประมาณของกรุงเทพมหานคร[1]

ในวันที่ 29 ธันวาคม พ.ศ. 2551 ได้มีคำสั่งกรุงเทพมหานคร ที่ 5313/2551 เรื่องลงโทษปลดคุณหญิงณัษฐนนท ทวีสิน อดีตปลัดกรุงเทพมหานคร พ้นจากตำแหน่งปลัดกรุงเทพมหานคร

ต่อมาในวันที่ ในวันที่ 21 ตุลาคม พ.ศ. 2557 ศาลปกครองกลางมีคำพิพากษาเพิกถอนคำสั่งกรุงเทพมหานคร ที่ 5313/2551 ลงวันที่ 29 ธ.ค. 2551 เรื่องลงโทษปลดคุณหญิงณัษฐนนท ทวีสิน อดีตปลัดกรุงเทพมหานคร พ้นจากตำแหน่งปลัดกรุงเทพมหานคร และเพิกถอนมติคณะกรรมการข้าราชการกรุงเทพมหานคร (ก.ก.) เมื่อวันที่ 27 พ.ค. 2552 วันที่ 24 มิ.ย. 2552 และวันที่ 17 ก.ย. 2552 ที่วินิจฉัยยกอุทธรณ์คำสั่งกรุงเทพมหานคร ที่ 5313/2551 และเพิกถอนคำสั่งรัฐมนตรีว่าการกระทรวงมหาดไทย เมื่อวันที่ 16 ส.ค. 2553 โดยให้มีผลย้อนหลังนับแต่วันที่มีคำสั่งหรือมติดังกล่าว[2]