เริ่มรับราชการในตำแหน่งอาจารย์ประจำคณะวิศวกรรมศาสตร์ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์ ประมาณ ปี 2526 ได้ย้ายมาเป็นอาจารย์ประจำสาขาบริหารอุตสาหการ คณะพาณิชยศาสตร์และการบัญชี มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ ควบกับการดำรงตำแหน่งรองผู้อำนวยการสถาบันประมวลข้อมูลเพื่อการศึกษาและพัฒนา มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ ในปี พ.ศ. 2537 ได้เข้ารับตำแหน่งรองผู้อำนวยการศูนย์เทคโนโลยีอิเล็กทรอนิกส์และคอมพิวเตอร์แห่งชาติ ดูแลในส่วนงานพัฒนาเครือข่ายคอมพิวเตอร์ และซอฟต์แวร์ จากนั้นได้ดำรงตำแหน่งผู้อำนวยการศูนย์เทคโนโลยีอิเล็กทรอนิกส์และคอมพิวเตอร์แห่งชาติ ในปี พ.ศ. 2539 จนครบวาระ 2 สมัย ในปี พ.ศ. 2547 และได้ดำรงตำแหน่ง รองผู้อำนวยการสำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ ในช่วงต่อมาจนถึง พ.ศ. 2552 คณะรัฐมนตรีมีมติเมื่อวันที่ 8 ธันวาคม พ.ศ. 2552 ให้ ดร.ทวีศักดิ์ กออนันตกูล ดำรงตำแหน่งผู้อำนวยการสำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ มีผลตั้งแต่ 1 กรกฎาคม พ.ศ. 2553 เป็นต้นไป โดยได้รับการต่อวาระในปี พ.ศ. 2556 ดร.ทวีศักดิ์ พ้นจากตำแหน่งผู้อำนวยการสำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติเมื่อวันที่ 26 สิงหาคม พ.ศ. 2559