ทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 309 แบ่งออกเป็น 3 ช่วง ช่วงต้นแยกจากบริเวณกิโลเมตรที่ 65 ของถนนพหลโยธิน ในอำเภอวังน้อย จังหวัดพระนครศรีอยุธยา มุ่งหน้าไปยังทิศตะวันตกเฉียงเหนือ ผ่านแยกทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 352 ผ่านนิคมอุตสาหกรรมโรจนะ จากนั้นตัดกับถนนสายเอเชียที่ทางแยกต่างระดับอยุธยา อำเภอพระนครศรีอยุธยา ผ่านวงเวียนเจดีย์วัดสามปลื้ม ผ่านสะพานสมเด็จพระนเรศวรมหาราช และสะพานสมเด็จพระเอกาทศรถ ข้ามทางรถไฟและแม่น้ำป่าสัก (ในอดีตสัญจรผ่านสะพานปรีดี-ธำรง แต่ในปัจจุบันใช้สะพานดังกล่าวโดยมีลักษณะขนานกับสะพานเดิม) เรียกชื่อถนนในช่วงตั้งแต่จุดเริ่มต้นจนถึงสะพานนี้ว่า ถนนโรจนะ เมื่อเข้าสู่เกาะอยุธยา จะเรียกว่า ถนนปรีดีพนมยงค์ ก่อนจะบรรจบกับถนนศรีสรรเพชญ์ ในเขตเทศบาลนครพระนครศรีอยุธยา เส้นทางจะไปตามถนนศรีสรรเพชญ์ ถนนป่าโทน ถนนคลองท่อ และถนนอู่ทอง

จากนั้นได้เริ่มต้น ช่วงอยุธยา–อ่างทอง โดยแยกจากถนนอู่ทอง บริเวณทิศเหนือของเกาะอยุธยา ผ่านสะพานข้ามคลองสระบัว (คูเมือง) มุ่งหน้าไปยังทิศตะวันตกเฉียงเหนือ เส้นทางจะขนานกับแม่น้ำเจ้าพระยา โดยถนนอยู่ฝั่งตะวันออก ผ่านอนุสาวรีย์สมเด็จพระนเรศวรมหาราช ตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 347 ที่แยกทุ่งมะขามหย่อง เข้าสู่จังหวัดอ่างทอง ตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 33 ที่อำเภอป่าโมก ตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 368 หรือถนนเลี่ยงเมืองอ่างทอง ก่อนจะไปบรรจบกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 334 ที่แยกบ้านรอ แล้วข้ามแม่น้ำเจ้าพระยาที่สะพานอ่างทอง อำเภอเมืองอ่างทอง

ช่วงอ่างทอง–สิงห์บุรี เริ่มต้นจากสี่แยกอ่างทอง บริเวณสถานีขนส่งอ่างทอง เส้นทางมุ่งหน้าไปทางทิศเหนือ ขนานไปกับแม่น้ำเจ้าพระยาโดยถนนอยู่ทางฝั่งตะวันตก ก่อนจะขนานไปกับคลองชลประทาน ผ่านอำเภอไชโย เข้าเขตจังหวัดสิงห์บุรี ที่อำเภอพรหมบุรี ก่อนจะแยกห่างจากคลองชลประทาน เส้นทางจะเลี้ยวขวาที่ทางแยกกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 3008 แล้วขนานไปกับคลองชลประทานอีกครั้งหนึ่ง ผ่านทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 3005 ตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 3026 เข้าสู่เขตเทศบาลเมืองสิงห์บุรี ตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 3030 (ถนนสิงห์บุรี–บางระจัน) สิ้นสุดที่สี่แยกศาลหลักเมือง โดยตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 369 หรือทางเลี่ยงเมืองสิงห์บุรี กับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 311