ทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 32 เริ่มต้นบนถนนพหลโยธิน และถนนกาญจนาภิเษกด้านตะวันตก ที่ทางแยกต่างระดับบางปะอิน 1 ในอำเภอบางปะอิน จังหวัดพระนครศรีอยุธยา มุ่งหน้าขึ้นไปทางเหนือ ผ่านนิคมอุตสาหกรรมไฮ-เทค เข้าสู่อำเภอพระนครศรีอยุธยา ผ่านศูนย์ราชการจังหวัดพระนครศรีอยุธยา, ศูนย์การค้าอยุธยาซิตี้พาร์ค ผ่านอำเภออุทัย ข้ามแม่น้ำป่าสักในตำบลบ่อโพง อำเภอนครหลวง ไปตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 347 ในอำเภอบางปะหัน (ช่วงนี้มี 12 ช่องจราจร แบ่งเป็นช่องทางหลัก 8 ช่อง และทางคู่ขนาน 4 ช่อง) จากนั้นมุ่งขึ้นไปทางเหนือ เข้าสู่จังหวัดอ่างทอง ผ่านอำเภอเมืองอ่างทอง และอำเภอไชโย เข้าสู่จังหวัดสิงห์บุรี ผ่านอำเภอพรหมบุรี, อำเภอเมืองสิงห์บุรี และอำเภออินทร์บุรี จากนั้นเข้าสู่จังหวัดชัยนาท ผ่านอำเภอสรรพยา, อำเภอเมืองชัยนาท และบรรจบกับถนนพหลโยธิน ที่แยกหลวงพ่อโอ ในอำเภอมโนรมย์ จังหวัดชัยนาท (ช่วงนี้มี 8 ช่องจราจร)