ทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 33 มีเส้นทางเริ่มต้นมาจากทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 340 ที่แยกไผ่ขวาง ในอำเภอเมืองสุพรรณบุรี จังหวัดสุพรรณบุรี เข้าสู่จังหวัดอ่างทอง ข้ามแม่น้ำเจ้าพระยา ในอำเภอป่าโมก เข้าสู่จังหวัดพระนครศรีอยุธยา ตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 32 และทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 347 ข้ามแม่น้ำป่าสักใน อำเภอนครหลวง ข้ามทางรถไฟสายชานเมือง ในอำเภอภาชี แล้วตัดกับถนนเลียบคลองระพีพัฒน์ จากนั้นเข้าสู่จังหวัดสระบุรี ตัดกับถนนพหลโยธิน ที่ทางแยกต่างระดับหินกอง อำเภอหนองแค จังหวัดสระบุรี ผ่านอำเภอวิหารแดง แล้วเข้าสู่จังหวัดนครนายก ที่อำเภอบ้านนา จากนั้นเข้าสู่อำเภอเมืองนครนายก ที่ตำบลพราหมณี จากนั้นข้ามแม่น้ำนครนายก สู่อำเภอปากพลี แล้วเข้าสู่จังหวัดปราจีนบุรี ที่อำเภอเมืองปราจีนบุรี ผ่านอำเภอประจันตคาม ตัดกับทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 304 ที่อำเภอกบินทร์บุรี บริเวณทางแยกกบินทร์บุรี (สามทหาร) จากนั้นวิ่งเลียบทางรถไฟสายตะวันออก เข้าสู่ จังหวัดสระแก้ว ที่อำเภอเมืองสระแก้วผ่านอำเภอวัฒนานคร ไปสิ้นสุดที่ชายแดนไทย-กัมพูชา อำเภออรัญประเทศ มีระยะทางตลอดทั้งสายรวม 299.549 กิโลเมตร