ทางหลวงแผ่นดินหมายเลข 340 เริ่มต้นที่ทางแยกต่างระดับบางบัวทอง บนกิโลเมตรที่ 49 ถึง 50 ของถนนกาญจนาภิเษกด้านตะวันตก ในอำเภอบางบัวทอง จังหวัดนนทบุรี เส้นทางออกไปทางทิศตะวันตกเฉียงเหนือ ผ่านอำเภอลาดหลุมแก้ว จังหวัดปทุมธานี, อำเภอไทรน้อย จังหวัดนนทบุรี, อำเภอลาดบัวหลวง และอำเภอบางซ้าย จังหวัดพระนครศรีอยุธยา, อำเภอบางปลาม้า จังหวัดสุพรรณบุรี จากนั้นเข้าสู่ตัวเมืองสุพรรณบุรี แล้วมุ่งหน้าไปทางทิศเหนือเข้าสู่อำเภอศรีประจันต์ อำเภอสามชุก อำเภอเดิมบางนางบวช เข้าสู่อำเภอหันคา จังหวัดชัยนาท เมื่อเข้าสู่อำเภอสรรคบุรี ที่สี่แยกสรรคบุรี เส้นทางจะเลี้ยวซ้ายเลียบคลองชลประทาน เข้าสู่อำเภอเมืองชัยนาท ข้ามแม่น้ำเจ้าพระยา แล้วไปสิ้นสุดที่สี่แยกแขวงการทาง ใกล้กับตัวเมืองชัยนาท โดยมีถนนพหลโยธินมาบรรจบทางด้านขวา เพื่อตรงไปมุ่งหน้าสู่จังหวัดนครสวรรค์