เมื่อสร้างแล้วเสร็จ พระบาทสมเด็จพระพุทธยอดฟ้าจุฬาโลกมหาราช ได้เสด็จออกว่าราชการที่ท้องพระโรง จนเมื่อสมเด็จพระเจ้าพี่นางเธอ กรมพระศรีสุดารักษ์สิ้นพระชนม์จึงได้เชิญพระศพมาประดิษฐานเป็นพระศพแรก จึงเป็นธรรมเนียมที่สามารถใช้พระมหาปราสาทนี้ประดิษฐานพระศพพระบรมวงศ์ที่ทรงโปรดเกล้าเป็นพิเศษได้ พระมหาปราสาทนี้ใช้เป็นที่ประดิษฐานพระบรมศพของพระมหากษัตริย์แทบทุกรัชกาล (ยกเว้นรัชกาลที่ 7) และพระบรมศพของพระอัครมเหสี (ยกเว้นสมเด็จพระศรีสุริเยนทราบรมราชินี) และพระบรมวงศ์ที่ทรงโปรดเกล้าเป็นพิเศษ อาทิ สมเด็จพระบรมโอรสาธิราช เจ้าฟ้ามหาวชิรุณหิศ สยามมกุฎราชกุมาร (เจ้านายฝ่ายหน้าพระองค์เดียวที่ได้ประดิษฐานบนพระมหาปราสาทนี้) สมเด็จพระเจ้าภคินีเธอ เจ้าฟ้าเพชรรัตนราชสุดา สิริโสภาพัณณวดี ซึ่งต่อมา (พ.ศ. 2559) ได้ประดิษฐานพระบรมศพพระบาทสมเด็จพระบรมชนกาธิเบศร มหาภูมิพลอดุลยเดชมหาราช บรมนาถบพิตร

พระที่นั่งองค์นี้ไม่ได้เป็นเพียงที่ประดิษฐานพระบรมศพและพระศพเท่านั้น ยังเป็นสถานที่เพื่อทำพระราชพิธีสำคัญด้วย อย่างเช่น เมื่อปี พ.ศ. 2454 ในรัชกาลพระบาทสมเด็จพระมงกุฎเกล้าเจ้าอยู่หัว ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้ตั้งการพระราชพิธีบรมราชาภิเษกสมโภช ณ พระที่นั่งดุสิตมหาปราสาท

ในปัจจุบัน พระที่นั่งดุสิตมหาปราสาทเป็นสถานที่ประกอบพระราชพิธี และ พระราชกุศลต่าง ๆ เช่น พระราชพิธีฉัตรมงคล (พระราชทานเครื่องราชอิสริยาภรณ์จุลจอมเกล้า) ในวันที่ 5 พฤษภาคม ของทุกปี