แบบแผนการเรียนแบบมหาวิทยาลัยนั้นเริ่มต้นตั้งแต่ยุคเอะโดะ เมื่อมีการก่อตั้งโรงเรียนพ่อค้า ในนาม ไคโตะคุโด ((懐徳堂) ขึ้นเมื่อปี ค.ศ. 1724 และโรงเรียนสอนศิลปวิทยาการตะวันตกสำหรับซามูไร หรือ รังงะกุ (適塾) ในนาม เทะกิจุกุ (適塾) โดยนายแพทย์โอะกะตะ โคอันเมื่อปี ค.ศ. 1838 จิตวิญญาณของมหาวิทยาลัยจึงดำรงไว้ซึ่งความเป็นมนุษยวิทยาที่ฝั่งรากอยู่ในโรงเรียนไคโตะคุโด และการศึกษาวิทยาศาสตร์ธรรมชาติและวิทยาศาสตร์ประยุกต์ รวมทั้งการแพทย์ ที่อยู่บนพื้นฐานของโรงเรียนเทะกิจุกุ

เมื่อปี ค.ศ. 1869 มีการก่อตั้งโรงเรียนแพทยศาสตร์จังหวัดโอซากะขึ้นที่ใจกลางเมืองโอซากะ หลังจากนั้น ในปี 1919 ได้ยกสถานะขึ้นเป็นวิทยาลัยแพทยศาสตร์จังหวัดโอซากะพร้อมกับเลื่อนสถานะเป็นมหาวิทยาลัยโดยกฤษฎีกาก่อตั้งมหาวิทยาลัย (กฤษฎีกาหลวง เลขที่ 388 ปี 1918) จากนั้น วิทยาลัยถูกควบรวมกับวิทยาลัยวิทยาศาสตร์ และสถาปนาเป็นมหาวิทยาลัยหลวงโอซากะในปี ค.ศ. 1931 จัดเป็นมหาวิทยาลัยหลวงแห่งที่ 6 ของญี่ปุ่น หลังจากนั้นอีก 2 ปี วิทยาลัยเทคนิคโอซากะได้ถูกผนวกรวมเข้ามาเป็นส่วนหนึ่งของมหาวิทยาลัย และกลายเป็นคณะวิศวกรรมศาสตร์ จนกระทั่งเมื่อปี ค.ศ. 1947 ได้เปลี่ยนชื่อเป็น มหาวิทยาลัยโอซากะ และได้ใช้ชื่อนี้มาจนถึงปัจจุบัน

ผลจากการปฏิรูประบบการศึกษาของรัฐบาลในปี ค.ศ. 1949 มหาวิทยาลัยโอซากะถูกควบรวมเข้ากับโรงเรียนมัธยมปลายนะนิวะและโรงเรียนมัธยมปลายโอซากะ และเริ่มต้นยุคใหม่หลังสงครามโลกครั้งที่ 2 ประกอบไปด้วย 5 คณะ ได้แก่ คณะวิทยาศาสตร์ คณะแพทยศาสตร์ คณะวิศวกรรมศาสตร์ คณะอักษรศาสตร์ และคณะนิติศาสตร์ หลังจากนั้น ได้มีการก่อตั้งคณะใหม่ตามมาอีกมากมาย รวมทั้งคณะวิทยาศาสตร์วิศวกรรมศาสตร์ (School of Engineering Science) ที่เป็นแหล่งศึกษาสู่ความเป็นเลิศทั้งด้านวิทยาศาสตร์และวิศวกรรมศาสตร์ จัดว่าเป็นคณะรูปแบบใหม่ในมหาวิทยาลัยแห่งชาติของญี่ปุ่นด้วย นอกจากนี้ยังมีการก่อตั้งคณะมนุษยศาสตร์ที่เน้นการเรียนการสอนแบบบูรณนาการทั้งจากสาขาจิตวิทยา สังคมศาสตร์ และศึกษาศาสตร์

และเมื่อครั้งที่มีการปฏิรูประบบการศึกษาของรัฐบาลอีกครั้งในปี ค.ศ. 1953 มหาวิทยาลัยโอซากะก็มีการเรียนการสอนระดับบัณฑิตวิทยาลัยทั้งหมด 10 คณะ ตามมาด้วยการก่อตั้งบัณฑิตวิทยาลัยในคณะภาษาศาสตร์และวัฒนธรรม และวิทยาลัยนโยบายสาธารณะระหว่างประเทศ จนกระทั่งมีบัณฑิตวิทยาลัยครบ 12 คณะในปี 1994

ในปี ค.ศ. 1993 ได้มีการย้ายโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยโอซากะจากวิทยาเขตนะงะโนะชิมะ ใจกลางเมืองโอซากะมายังวิทยาเขตซุอิตะ ตามมาด้วยการรวมเอาสถาบันต่างๆที่กระจัดกระจายอยู่ในวิทยาเขตซุอิตะและโทะโยะนะกะเข้ามาไว้ด้วยกัน จนกระทั่งเมื่อเดือนตุลาคม ค.ศ. 2007 มหาวิทยาลัยโอซากะได้ผนวกรวมเข้ากับมหาวิทยาลัยโอซากะสาขาต่างประเทศศึกษา ทำให้มหาวิทยาลัยแห่งนี้เป็นหนึ่งในสองมหาวิทยาลัยในญี่ปุ่นที่มีวิทยาลัยต่างประเทศศึกษาอยู่ด้วย (อีกแห่งคือ มหาวิทยาลัยโตเกียวสาขาต่างประเทศศึกษา) นอกจากนี้ การผนวกรวมในครั้งนี้ยังทำให้มหาวิทยาลัยโอซากะเป็นมหาวิทยาลัยที่ใหญ่ที่สุดในญี่ปุ่นอีกด้วย