ลำเซบายมีต้นกำเนิดจากสันปันน้ำของลุ่มน้ำเซบายและลุ่มน้ำห้วยบังอี่บริเวณพื้นที่ตำบลกุดเชียงหมี อำเภอเลิงนกทา จังหวัดยโสธร ไหลผ่านอำเภอไทยเจริญ อำเภอป่าติ้ว อำเภอคำเขื่อนแก้ว จังหวัดยโสธร อำเภอเสนางคนิคม อำเภอหัวตะพาน อำเภอเมืองอำนาจเจริญ จังหวัดอำนาจเจริญ อำเภอเขื่องใน อำเภอม่วงสามสิบ และไหลไปรวมกับแม่น้ำมูลที่บ้านจานตะโนน ตำบลหนองบ่อ อำเภอเมืองอุบลราชธานี จังหวัดอุบลราชธานี มีความยาวประมาณ 233 กิโลเมตร ซึ่งใช้ประโยชน์เพื่อการเกษตรกรรมเป็นส่วนใหญ่ มีปริมาณน้ำท่าตามธรรมชาติประมาณปีละ 1,666 ล้าน ลบ.ม. หรือประมาณร้อยละ 8.54 ของปริมาณน้ำท่าตามธรรมชาติทั้งหมดของลุ่มน้ำมูล