การเจริญเติบโตที่ผิดปกติเป็นปุ่มปมจากเชื้อ Agrobacterium sp.
อโกรแบคทีเรียม ชนิดพันธุ์ Agrobacterium tumefaciens ทำให้เกิดโรคคราวน์กอลล์ (Crown gall) ในพืช โรคนี้มีลักษณะโดยการเจริญเติบโตเหมือนเนื้องอกหรือถุงน้ำดีบนพืชที่ติดเชื้อ ซึ่งมักจะอยู่ที่รอยต่อระหว่างรากและหน่อ ปุ่มปมถูกกระตุ้นโดยการถ่ายโอนคอนจูเกตของส่วนของสายดีเอ็นเอ (T-DNA) จากพลาสมิดของแบคทีเรียที่ก่อให้เกิดปุ่มปม (Ti) ในอีกชนิดพันธุ์ที่มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดคือ Agrobacterium rhizogenes ก็ชักนำให้เกิดปุ่มปมในราก และมีพลาสมิดของ Ri (Root-inducing) ซึ่งเป็นพลาสมิดที่แตกต่างกัน ถึงแม้ว่าอนุกรมวิธานของ อโกรแบคทีเรียม จะอยู่ภายใต้การแก้ไข แต่ก็สามารถสรุปได้ว่าในสกุลมี 3 Biovars คือชนิดพันธุ์ Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes และ Agrobacterium vitis สำหรับสายพันธุ์ย่อยของ Agrobacterium tumefaciens และ Agrobacterium rhizogenes นั้นเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถเป็นที่อยู่ของ Ti หรือ Ri-plasmid ได้ในขณะที่สายพันธุ์โดยทั่วไปของ Agrobacterium vitis (จำกัดเฉพาะที่พบในเถาองุ่น) สามารถเป็นที่อยู่ของ Ti-plasmid เท่านั้น ขณะเดียวกันสายพันธุ์ที่ไม่ใช่อโกรแบคทีเรียม ที่ถูกแยกออกจากตัวอย่างแวดล้อมก็สามารถเป็นที่อยู่ของ Ri-plasmid ได้ ในขณะที่การศึกษาในห้องปฏิบัติการแสดงให้เห็นว่าสายพันธุ์ที่ไม่ใช่อโกรแบคทีเรียม ยังสามารถเป็นที่อยู่ของ Ti-plasmid ด้วย แต่อโกรแบคทีเรียมสายพันธุ์แวดล้อมบางสายพันธุ์ไม่มีทั้ง Ti และ Ri-plasmid ทำให้สายพันธุ์เหล่านี้มีความสามารถก่อโรคได้ต่ำ[6]
พลาสมิด T-DNA นั้นถูกรวมเข้าแบบกึ่งสุ่มเข้าไปในจีโนมของเซลล์เจ้าบ้าน[7] และยีนกำหนดสัณฐานวิทยาของปุ่มปมบน T-DNA นั้นแสดงออกมา ทำให้เกิดการสร้างปุ่มปม สำหรับ T-DNA ที่นำพายีนของเอนไซม์สำหรับการสังเคราะห์ทางชีวภาพในการผลิตกรดอะมิโนที่ผิดปกตินั้นโดยทั่วไปจะเป็น Octopine หรือ Nopaline ยังมียีนสำหรับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฮอร์โมนพืชคือ ออกซินและไซโตไคนิน และสำหรับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ Opine ซึ่งจัดหาแหล่งคาร์บอนและไนโตรเจนสำหรับแบคทีเรีย ซึ่งจุลินทรีย์ชนิดอื่น ๆ ส่วนใหญ่ไม่สามารถใช้ได้ ทำให้อโกรแบคทีเรียมเป็นชนิดที่ถูกคัดสรรให้ได้รับประโยชน์ดังกล่าว[8] จากการปรับสมดุลฮอร์โมนในเซลล์พืชทำให้การแบ่งเซลล์เหล่านั้น ไม่สามารถควบคุมได้โดยพืชและก่อให้เกิดปุ่มปม อัตราส่วนของออกซินต่อไซโตไคนินที่ผลิตโดยยีนของปุ่มปมกำหนดลักษณะสัณฐานวิทยาของปุ่มปม (ลักษณะคล้ายรากที่ไม่เป็นระเบียบหรือยอดอ่อนที่ไม่เป็นระเบียบ)
กลไกการก่อโรคในพืช
- Transformation คือ T-DNA เข้าสู่จีโนมพืช
- Tumorigenis คือ เซลล์พืชเกิดการเปลี่ยนโดยการแบ่งเซลล์ตลอดเวลาเป็นจำนวนมากก่อให้เกิดปุ่มปม
องค์ประกอบในจีโนมของอโกรแบคทีเรียม
- โครโมโซม
- พลาสมิด ได้แก่
พลาสมิดที่เหนี่ยวนำให้เกิดเนื้องอก Tumor inducer plasmid (Ti plasmid), พลาสมิดที่เหนี่ยวนำให้เกิดราก Root inducer plasmid (Ri plasmid)
พลาสมิด Ti
มีขนาด 200-800 กิโลเบส[9] ประกอบด้วย
- Transfer DNA (T-DNA) มีขนาด 10-30 กิโลเบส ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์แบคทีเรีย เป็นเพียง 10% ของพลาสมิด หลังจากเกิดการบุกรุกโดยแบคทีเรียบโมเลกุลของ T-DNA จะอยู่อย่างถาวรในเซลล์พืชและส่งผ่านไปสู่เซลล์ลูกเป็นส่วนหนึ่งของโครโมโซม T-DNA มียีนประมาณ 8 ยีน มียีนทีกำหนดการสร้างสารต่าง ๆ ที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตของแบคทีเรียเอง โดยใช้เอนไซม์และสารตั้งต้นจากพืช ตัวอย่างเช่นยีนที่กำหนดการสร้างโอปีน Opaline synthase (nos) ซึ่งแบคทีเรียจะใช้เป็นอาหารดังนั้นการที่ A. tumefaciens ถ่ายยีนเข้าสู่พืชมีวัตถุประสงค์คือต้องการอาหารจากพืชเพื่อประโยชน์ของแบคทีเรียเอง นอกจากนี้ยังประกอบด้วยยีน tra รวมทั้งยีนที่กำหนดให้แบคทีเรียสามารถใช้สารบางชนิดเป็นแหล่งพลังงานได้ เช่น Arginine catabolism, Nopaline catabolism, Octopine catabolism นอกจากนี้ยังมียีนสร้างฮอร์โมนพวกออกซินและไซโตไคนินอีกด้วย ทำให้พืชที่ได้รับ T-DNA มีการเจริญเติบโตเร็วไม่จำกัดซึ่งแสดงออกในเซลล์พืชเมื่อบุกรุกเข้าไปในเซลล์ ทำให้เกิดเนื้องอกเป็นปุ่มปม ในพืชใบเลี้ยงคู่หลายชนิด และสามารถตรวจสอบพืชที่ได้รับยีนนี้โดยพิจารณาจากปุ่มปมที่เกิดขึ้นในเซลล์ที่ได้รับยีนนี้ จากนั้น T-DNA จะเข้าไปรวมกับโครโมโซมของพืช
- Virulence genes หรือ Vir genes มีลักษณะเป็นกลุ่มยีนที่ทำงานร่วมกันโดยใช้โปรโมเตอร์ชนิดเดียวกัน เรียกว่า โอเปอรอน (Operon) โดย Vir genes มีหน้าที่ส่ง T-DNA เข้าสู่จีโนมพืช Vir genesประกอบด้วย
- VirA/VirG เป็นระบบที่ทำหน้าที่ควบคุม ได้แก่ โปรตีน VirA มีหน้าที่สังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตแก่ VirA เอง และสังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตให้แก่ VirG โดย VirA จะทำการกระตุ้นการทำงานของ VirG เมื่อ VirG ทำงานก็จะกระตุ้นการทำงานของ Vir อื่น ๆ ต่อไป
- VirD1/VirD2 ทำหน้าที่ตัดบริเวณส่วน T-DNA บริเวณ Right border, Left border เพื่อให้ได้ T-DNA สายเดี่ยวจากสายคู่เพื่อที่จะได้เข้าสู่เซลล์พืชแบบ Single strand T-DNA
- VirE2 ทำหน้าที่ห่อหุ้ม T-DNA สายเดี่ยวเพื่อป้องกันไม่ให้โดนทำลาย โดยสร้างส่วนห่อหุ้มเรียกว่า T-complex
- Octopine catabolism ทำหน้าที่สร้างแหล่งพลังงานประเภทสารประกอบไนโตรเจนให้แก่อโกรแบคทีเรียม
- Conjugation transfer gene
- Ori เป็นบริเวณที่เริ่มการจำลองตัว
พลาสมิด Ri
มีความสนใจในการพัฒนาพืชที่ถูกโคลนด้วยพาหะที่มีพื้นฐานมาจากพลาสมิด Ri ของ A. rhizogenes พลาสมิด Ri และ Ti เหมือนกันมากแต่ที่ต่างกันคือการถ่ายทอดพลาสมิด Ri ไปสู่พืชไม่ทำให้เกิดปุ่มปมแต่จะทำให้เกิดปุ่มปมแต่จะทำให้เกิดรากฝอยขึ้นแทน มีความเป็นไปได้ในการเลี้ยงรากที่ได้รับการถ่ายยีนให้มีปริมาณมากในอาหารเหลว เพื่อที่จะนำไปสกัดโปรตีนที่ผลิตจากยีนที่ต้องการในปริมาณสูงได้
กลไกการถ่าย T-DNA เข้าสู่พืช
A: Agrobacterium tumefaciens
B: จีโนมของอโกรแบคทีเรียม
C: พลาสมิด Ti : a: T-DNA, b: ยีน Vir, c: Replication origin, d: Opines catabolism genes
D: เซลล์พืช
E: ไมโตรคอนเดรีย
F: คลอโรพลาสต์
G: นิวเคลียส
- Bacterial colonization แบคทีเรียอโกรแบคทีเรียม จะมาเกาะรวมกันบริเวณขอบเซลล์พืช ที่บริเวณพื้นผิวเซลล์พืชมีสารพอลิแซ็กคาไรด์ซึ่งมีส่วนสำคัญในการยึดเกาะของแบคทีเรีย
- Induction of bacterial virulence system เมื่อพืชเกิดบาดแผลจะปล่อยสารออกมาจากบาดแผล เช่น กรด, สารฟีโนลิก, สารอะซิโตไซริงโกน โดยสารเหล่านี้จะไปกระตุ้น Periplasmic domain ที่เป็นตัวรับสัญญาณของ VirA และส่วน TM2 ที่ทำหน้าที่ผลิตเอนไซม์ Kinase ใน VirA โปรตีน VirA จะทำหน้าที่สังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตแก่ VirA เอง และสังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตให้แก่ VirG โดย VirA จะทำการกระตุ้นการทำงานของ VirG เมื่อ VirG ทำงานก็จะกระตุ้นการทำงานของ Vir อื่น ๆ ต่อไป
- Generation of T-DNA transfer complex การสร้าง T-DNA ให้มีความซับซ้อนขึ้นเพื่อป้องกันการถูกทำลาย โดย VirD1/VirD2 ซึ่งเป็นเอนไซม์เอนโดนิวคลีเอสจะตัดพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ที่ตำแหน่ง Right border (RB), Left border (LB) ที่ขนาบด้านขวาและซ้ายของ T-DNA ตามลำดับ เกิดเป็น T-DNA สายเดี่ยวจากสายคู่เพื่อที่จะได้เข้าสู่เซลล์พืชแบบ single strand T-DNA จากนั้น VirE2 ทำหน้าที่ห่อหุ้ม T-DNA สายเดี่ยว เพื่อป้องกันไม่ให้โดนทำลาย เป็นโครงสร้าง เรียกว่า T-complex ทั้ง VirD2 และ VirE2 จะทำงานร่วมกันโดยรับสัญญาณเพื่อนำ T-DNA เข้าไปสู่นิวเคลียสของเซลล์พืช
- T-DNA transfer T-DNA ถูกย้ายสู่พืช
- Integration of T-DNA into plant genome การขนย้าย T-complex จากอโกรแบคทีเรียมเข้าสู่จีโนมพืช VirD2 และ VirE2 จะทำงานร่วมกันโดยรับสัญญาณเพื่อนำ T-DNA เข้าไปสู่นิวเคลียสของพืช โดยเกิดการแทรกแบบสุ่มชนิด Nonspecific recombination (Illegimate)
ข้อจำกัดของการโคลนด้วยพลาสมิด A. tumefaciens
ธรรมชาติของ A. tumefaciens และ A. rhizogenes จะบุกรุกเฉพาะพืชใบเลี้ยงคู่เท่านั้นส่วนพืชใบเลี้ยงเดี่ยวไม่ใช่เจ้าบ้าน และปัญหาอีกประการคือการพัฒนาเป็นพืชที่สมบูรณ์จากโปรโทพลาสต์ หรือจากเซลล์เพาะเลี้ยงทำได้ยากและจำกัดในพืชบางชนิด ความยากง่ายของการเจริญเป็นต้นขึ้นอยู่กับชนิดของพืช และที่พัฒนาได้ยากก็คือพืชใบเลี้ยงเดี่ยว
