เขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่-ห้วยขาแข้งได้ขึ้นทะเบียนเป็นแหล่งมรดกโลกเมื่อปี พ.ศ. 2534 ในการประชุมคณะกรรมการมรดกโลกสมัยสามัญครั้งที่ 15 ที่เมืองคาร์เทจ ประเทศตูนิเซีย โดยผ่านข้อกำหนดและหลักเกณฑ์ในการพิจารณาให้เป็นแหล่งมรดกโลก ดังนี้

• (vii) - เป็นแหล่งที่เกิดจากปรากฏการณ์ทางธรรมชาติที่มีเอกลักษณ์หายากหรือสวยงามเป็นพิเศษ เช่น แม่น้ำ น้ำตก ภูเขา
• (ix) - เป็นตัวอย่างที่เด่นชัดในการเป็นตัวแทนของกระบวนการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญทางธรณีวิทยาหรือวิวัฒนาการทางชีววิทยา และปฏิสัมพันธ์ของมนุษย์ต่อสิ่งแวดล้อมทางธรรมชาติที่กำลังเกิดอยู่ เช่น ภูเขาไฟ เกษตรกรรมขั้นบันได
• (x) - เป็นถิ่นที่อยู่อาศัยของชนิดสัตว์และพันธุ์พืชที่หายากหรือที่ตกอยู่ในสภาวะอันตราย แต่ยังคงสามารถดำรงชีวิตอยู่ได้ ซึ่งรวมถึงระบบนิเวศอันเป็นแหล่งรวมความหนาแน่นของพืชและสัตว์ที่ทั่วโลกให้ความสนใจด้วย

โดยได้รับการขึ้นทะเบียนเป็นแหล่งมรดกโลกพร้อมกันกับนครประวัติศาสตร์พระนครศรีอยุธยาและเมืองประวัติศาสตร์สุโขทัยและเมืองบริวาร และเป็นแหล่งมรดกโลกทางธรรมชาติแห่งแรกของประเทศไทย