เจ้าชายนิโคไลแห่งเดนมาร์กประสูติเมื่อวันที่ 28 สิงหาคม พ.ศ. 2542 ณ โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยโคเปนเฮเกน (Rigshospitalet)[1] เป็นพระโอรสพระองค์ใหญ่ในเจ้าชายโจอาคิมแห่งเดนมาร์ก กับเคาน์เตสอเล็กซันดราแห่งเฟรเดอริกสบอร์ก อดีตพระชายา เป็นพระราชนัดดาพระองค์แรกในสมเด็จพระราชินีนาถมาร์เกรเธอที่ 2 แห่งเดนมาร์ก กับเจ้าชายเฮนริกแห่งเดนมาร์ก พระราชสวามี เจ้าชายนิโคไลมีพระอนุชาร่วมพระมารดาคือ เจ้าชายเฟลิกซ์ และมีพระอนุชาและพระขนิษฐาต่างพระมารดาคือเจ้าชายเฮนริก[2][3] และเจ้าหญิงอะธีนา

เจ้าชายนิโคไลได้ทำพิธีบัพติศมาในโบสถ์น้อยในพระราชวังเฟรเดนสบอร์ก เมื่อวันที่ 6 พฤศจิกายน 2542 พระองค์มีพ่อทูนหัว ซึ่งเป็นพระปิตุลาฝ่ายพระชนก เจ้าชายเฟรเดอริก มกุฎราชกุมารแห่งเดนมาร์ก, เจ้าชายเอ็ดเวิร์ด เอิร์ลแห่งเวสเซ็กส์ และปีเตอร์ สทีนทรัป (Peter Steentrup) ส่วนแม่ทูนหัวที่เป็นพระมาตุจฉาฝ่ายพระมารดา ได้แก่ นิโคลา แบร์ด (Nicola Baird) และคามิลลา ฟลินต์ (Camilla Flint)

พระชนกและพระชนนีของพระองค์ได้ประกาศว่าทรงแยกกันอยู่เมื่อวันที่ 16 กันยายน พ.ศ. 2547 ก่อนที่จะทรงหย่ากันเมื่อวันที่ 8 เมษายน พ.ศ. 2548 โดยก่อนการหย่าเคาน์เตสอเล็กซานดราไม่มีแผนที่จะเสด็จออกจากเดนมาร์ก[4] อย่างไรก็ตามหลังจากการหย่า เคานต์เตสอเล็กซานดรา ก็ยังทรงพำนักและทรงงานในเดนมาร์กต่อไปเพื่อที่ร่วมกับเจ้าชายโจอาคิมใช้สิทธิในการดูแลพระโอรสทั้งสอง แม้ว่าภายหลังเคาน์เตสจะสมรสใหม่และเสียอิสริยยศชั้นเจ้าหญิงไปก็ตาม[5][6]

ส่วนพระชนกของพระองค์ ทรงหมั้นกับมารี กาวัลลีเย วันที่ 3 ตุลาคม พ.ศ. 2550 ก่อนที่จะทรงอภิเษกสมรสในวันที่ 24 พฤษภาคม พ.ศ. 2551[7] โดยในความสัมพันธ์ระหว่างเจ้าหญิงมารีแห่งเดนมาร์ก ซึ่งถือเป็นพระมารดาเลี้ยงของพระองค์และพระอนุชา คือ เจ้าชายเฟลิกซ์ และทั้งคู่เข้ากันได้ดีกับพระมารดาเลี้ยง[8]