พี่น้องชาวอเมริกันเชื้อสายอิตาลี มาริโอกับลุยจิได้เริ่มดำเนินธุรกิจช่างประปาในบรุกลิน พ่อของพวกเขาไม่เห็นด้วยกับการตัดสินใจของมาริโอที่ลาออกจากงานประจำที่อยู่ภายใต้อดีตนายจ้างที่เป็นคู่อริของพวกเขาสไปค์ หลังจากที่ได้เห็นข่าวการรั่วของท่อระบายน้ำครั้งใหญ่ มาริโอกับลุยจิได้ลงไปยังชั้นใต้ดินเพื่อซ่อมท่อแต่ถูกดูดเข้าไปในท่อวาร์ปและแยกจากกัน

มาริโอโผล่ไปยังอาณาจักรเห็ดซึ่งปกครองโดยเจ้าหญิงพีช ในขณะที่ลุยจิโผล่ไปยังพิภพมืดซึ่งปกครองโดยคูปาผู้ชั่วร้ายราชาบาวเซอร์ บาวเซอร์พยายามที่จะแต่งงานกับพีชและตั้งใจที่จะทำลายอาณาจักรเห็ดโดยใช้ซุปเปอร์สตาร์หากเธอปฏิเสธ เขากักขังลุยจิเพื่อข่มขู่มาริโอซึ่งเขามองว่าเป็นคู่แข่งทางความรักที่มีต่อพีช มาริโอพบกับโท้ดซึ่งพาเขาไปพบกับพีช พีชวางแผนที่จะเป็นพันธมิตรกับเหล่าคองเพื่อช่วยขับไล่บาวเซอร์และตกลงที่จะพามาริโอกับโท้ดไปด้วย ในอาณาจักรพงไพร ราชาแครงกี้ คอง ตกลงที่จะช่วยโดยมีเงื่อนไขว่ามาริโอจะต้องเอาชนะดองกี้ คอง ลูกชายของเขาในการต่อสู้ ถึงแม้ว่าดองกี้ คองจะแข็งแกร่ง แต่มาริโอก็ชนะเขาได้ด้วยชุดแมว

มาริโอ พีช โท้ดและเหล่าคองใช้รถคาร์ทเพื่อขับกลับไปยังอาณาจักรเห็ดแต่กองทัพของบาวเซอร์ซุ่มโจมตีพวกเขาบนถนนสายรุ้ง เมื่อนายพลคูปาทำลายถนนบางส่วน มาริโอกับดองกี้ คองได้ร่วงตกไปยังมหาสมุทรและถูกกินโดยตัวมาว-เรย์ที่คล้ายกับปลาไหลในขณะที่เหล่าคองที่เหลือถูกจับตัวไป พีชกับโท้ดกลับไปยังอาณาจักรเห็ดและประกาศให้ชาวเมืองอพยพ บาวเซอร์เดินทางมาถึงด้วยปราสาทลอยได้ของเขาและขอพีชแต่งงาน พีชยินยอมอย่างไม่เต็มใจหลังจากที่ปรึกษาของบาวเซอร์คาเม็กทรมานโท้ด ส่วนมาริโอกับดองกี้ คองหลุดออกจากตัวมาว-เรย์ด้วยการขี่จรวดจากรถคาร์ทของดองกี้ คองและรีบไปงานแต่งงานของบาวเซอร์กับพีช

ที่งานเลี้ยงแต่งงาน บาวเซอร์ตั้งใจที่จะสังเวยเชลยทั้งหมดของเขาด้วยลาวาเพื่อเป็นเกียรติแก่พีช โท้ดแอบนำดอกไม้น้ำแข็งซ่อนในช่อดอกไม้ของพีช ซึ่งพีชใช้มันแช่แข็งบาวเซอร์ มาริโอกับดองกี้ คองเดินทางมาถึงและปลดปล่อยเชลยโดยมาริโอใช้ชุดทานุกิเพื่อช่วยเหลือลุยจิ บาวเซอร์ที่โกรธเกรี้ยวหลุดออกจากน้ำแข็งและเรียกใช้บอมเบอร์บิลเพื่อทำลายปราสาทของพีชแต่มาริโอขัดขวางมันได้สำเร็จและนำมันเข้าไปในท่อวาร์ป ทำให้ปราสาทของบาวเซอร์ถูกส่งไปยังบรุกลิน ในขณะที่พวกเขาต่อสู้กับบาวเซอร์ มาริโอกับลุยจิได้แย่งชิงซุปเปอร์สตาร์มาได้ทำให้เป็นอมตะและเอาชนะเหล่าคูปาได้ บาวเซอร์ถูกย่อให้เล็กด้วยเห็ดย่อส่วนและถูกขังอยู่ในขวดโหล มาริโอกับลุยจิได้รับชื่อเสียงโด่งดังจากชาวเมืองบรุกลินรวมถึงพอแม่ของพวกขาและสไปค์ หลังจากการต่อสู้ มาริโอกับลุยจิได้ย้ายเข้าไปอยู่ในบ้านหลังใหม่ด้วยกันในอาณาจักรเห็ด