เดเมโคลไซคลีนจัดเป็นยาปฏิชีวนะอีกชนิดหนึ่งที่ออกฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรีย (bacteriostatic agent) เนื่องจากยานี้เป็นยาในกลุ่มเตตราซัยคลีน จึงมีกลไกลการออกฤทธิ์ที่คล้ายคลึงกับสมาชิกอื่นในกลุ่ม โดยเดเมโคลไซคลีนจะเข้าจับกับหน่วยย่อย 30 เอสของไรโบโซมแบคทีเรีย เพื่อป้องกันไม่ให้อะมิโนเอซิลทีอาร์เอ็นเอเข้าจับกับตำแหน่งดังกล่าวได้ ส่งผลให้กระบวนการการสังเคราะห์โปรตีนของแบคทีเรียนั้นหยุดชะงักลงในที่สุด

นอกจากนี้ เดเมโคลไซคลีนยังออกฤทธิ์ขัดขวางการทำงานของเอนไซม์วาโซเพรสซิน (vasopressin) บริเวณหน่วยไต โดยการรบกวนการทำงานระบบตัวสื่อสัญญาณที่สอง (secondary messenger) ภายในเซลล์ (โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การยับยั้งการกระตุ้นอะดีลินิลไซเคลส) หลังจากที่ฮอร์โมนดังกล่าวเข้าจับกับตัวรับอาร์จินีนวาโซเพรสซินชนิดที่ 2 (vasopressin V2 receptor) ในไต[7][9][10] อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์โดยละเอียดของเดเมโคลไซคลีนในกระบวนการดังกล่าวนั้นยังไม่ได้รับการอธิบายให้แน่ชัเได้เท่าใดนัก[10]