3′-5′ เอกโซนิวคลีเอส เป็นการทำงานพื้นฐานของดีเอ็นเอพอลิเมอเรสทั้งสามชนิด (I, II, III) ซึ่งเรียกการทำงานลักษณะนี้ว่า proofreading activity คือความสามารถของดีเอ็นเอพอลิเมอเรสในการตรวจสอบลำดับของนิวคลีโอไทด์ในสายดีเอ็นเอทุกครั้งที่มีการนำดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ตัวใหม่มาต่อ จึงทำให้ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสสามารถทำงานในทิศทาง 3′ ไปยัง 5′ ของสายดีเอ็นเอที่สร้างใหม่ได้ เมื่อตรวจสอบพบตำแหน่งเบสที่ผิด จะมีการตัดเบสดังกล่าวทิ้งแล้วนำตัวใหม่ที่ถูกต้องมาต่อแทน

นอกจากนี้ยังมี 5′-3′ เอกโซนิวคลีเอส เป็นรูปแบบการทำงานที่พบในดีเอ็นเอพอลิเมอเรส I เท่านั้นซึ่งจะใช้ในการกำจัด RNA primer ออกจาก lagging strand และใช้ในการซ่อมแซมส่วนของการสังเคราะห์ที่ผิดพลาด (repair mutation) โดยทิศทางการตัดจะตัดจาก 5′ ไปยัง 3′ ของสายดีเอ็นเอ ซึ่งมีทิศทางตรงกันข้ามกับ 3′-5′ เอกโซนิวคลีเอส[2]