ลิตเทิลวิตช์แอคาดีเมีย ดำเนินเรื่องไปที่สถาบันเวทมนตร์ลูนาโนวา (ญี่ปุ่น: ルーナノヴァ魔法学校 โรมาจิ: Rūna Nova Mahō Gakkō; อังกฤษ: Luna Nova Magical Academy) ซึ่งเป็นโรงเรียนสำหรับหญิงสาวที่ต้องการฝึกฝนเพื่อเป็นแม่มด โดยมีหญิงสาวชื่อคาการิ อาสึโกะ หรือ อักโกะ ได้รับแรงบันดาลใจจากแม่มดชื่อ ไซน์นี ชาริออท ในการเข้าเรียนสถานบันเวทมนตร์แห่งนี้ ทว่าเธอไม่มีพลังเวทมนตร์เลยจึงต้องดิ้นรนอย่างหนัก ทุกอย่างเปลี่ยนไปเมื่อเธอค้นพบกับ ไซน์นีร็อด พลังเวทมนตร์ที่เป็นของตกทอดมาจาก ชาริออท

หนึ่งในธีมหลักของแฟรนไชส์นี้คือ อักโกะ พยายามสานต่ออุดมการณ์ของ ไซน์นี ชาริออท คือเวทมนตร์เป็นสิ่งที่มหัศจรรย์บนโลกใบนี้ ขณะที่ ลูนาโนวา ต้องดิ้นรนฟันฝ่าเพื่อไม่ให้เวทมนตร์กำลังจะหายไป เพราะเวทมนตร์สำหรับโลกและสาธารณชนทั่วไปถือว่าล้าสมัยแล้ว ทั้งในภาพยนตร์สั้นและละครชุดทางโทรทัศน์ ดำเนินเรื่องกับ อักโกะ และผองเพื่อน, ลอตเต้ และ ซูซี่ ในการผจญภัยค้นหาประสบการณ์เวทมนตร์ใหม่ ๆ ร่วมกัน ความลับในการนำพลังเวทมนตร์กลับมานั้นอยู่ในป่าต้องห้ามอาร์กทูรัส และถูกผนึกอยู่ในชุมชนเวทมนตร์ที่มีชื่อว่าแกรนด์ไทรสเกเลียน (Grand Triskelion) ซึ่งก่อตั้งโดยกลุ่มแม่มดอาวุโสทั้งเก้า

กุญแจในการแก้ผนึกนั้น อยู่ที่การจัดลำดับคำแห่งเวทมนตร์ทั้งเจ็ด และคฑาแววาว ซึ่งเป็นสิ่งประดิษฐ์ที่จะตอบรับต่อผู้ใช้ที่ต้องการจะเผยแผ่ความสุขและความสนุกอย่างจริงใจเท่านั้น เมื่ออักโกะได้เป็นเจ้าของคฑา ชาริออทพยายามที่จะนำทางเพื่อให้เธอได้นำพลังเวทมนตร์กลับมาสู่โลก หากแต่ครอย ผู้เคยเป็นเพื่อนสนิทของชาริออทก็เคยอยากได้พลัง แต่กลับถูกปฏิเสธเพราะความทะเยอทะยานอันเห็นแก่ตัวของเธอ