ภาพยนตร์เปิดเรื่องในช่วงฤดูหนาว ปี ค.ศ. 1934 แอร์กูล ปัวโร นักสืบชาวเบลเยียมไขคดีโจรกรรมในกรุงเยรูซาเลมได้สำเร็จ ก่อนจะเดินทางไปพักผ่อนที่อิสตันบูล แต่เขากลับได้รับโทรเลขเกี่ยวกับคดีจากลอนดอนทำให้เขาต้องรีบเดินทางกลับด้วยรถด่วนโอเรียนท์เอกซ์เพรส โดยได้รับความอนุเคราะห์จากบุค เพื่อนของเขา ขณะอยู่บนรถไฟ ปัวโรพบกับแรตเช็ตต์ นักธุรกิจชาวอเมริกันผู้เชื่อว่าตนกำลังถูกปองร้าย เขาเสนอให้ปัวโรเป็นบอดี้การ์ดของเขา แต่ปัวโรปฏิเสธ ในคืนนั้น ปัวโรได้ยินเสียงแปลก ๆ มาจากห้องของแรตเช็ตต์และเห็นผู้หญิงสวมชุดกิโมโนสีแดงวิ่งหายไปจากทางเดิน ขณะเดียวกัน หิมะถล่มทำให้รถไฟตกราง

เช้าวันต่อมา ปัวโรพบว่าแรตเช็ตต์ถูกฆ่าตาย มีบาดแผลถูกแทง 12 แผล เขากับบุคจึงร่วมกันสืบคดี ทั้งสองพบหลักฐานหลายอย่างที่บ่งชี้ว่าฆาตกรลงมือคนเดียว ด้านคุณนายฮับบาร์ดซึ่งห้องติดกับแรตเช็ตต์บอกปัวโรว่าเมื่อคืน เธอเห็นผู้ชายอยู่ในห้องของเธอ ต่อมาปัวโรพบเบาะแสที่เชื่อมโยงแรตเช็ตต์กับคดีลักพาตัวเดซี อาร์มสตรอง โดยตัวตนที่แท้จริงของแรตเช็ตต์คือคาสเซตติ โจรลักพาตัวที่จับเดซี ลูกสาวของผู้พันจอห์นและโซเนีย อาร์มสตรองไปเรียกค่าไถ่ เมื่อครอบครัวอาร์มสตรองยอมจ่ายเงินค่าไถ่ พวกเขากลับพบว่าเดซีถูกฆ่าตาย ทำให้โซเนียเสียใจมากจนแท้งลูกและเสียชีวิต ส่วนจอห์นตัดสินใจยิงตัวตาย ด้านซูซาน คนรับใช้ของครอบครัวอาร์มสตรองถูกจับกุม แต่เธอฆ่าตัวตาย ก่อนที่ผลการสืบสวนจะพบว่าเธอเป็นผู้บริสุทธิ์

ปัวโรพบหลักฐานสำคัญ เช่น ผ้าเช็ดหน้าที่ปักตัวอักษร "H", ชุดกิโมโนสีแดงและเครื่องแบบพนักงานรถไฟ หลังสอบปากคำผู้โดยสารทุกคน ปัวโรพบว่าทั้งหมดมีความเชื่อมโยงกับคดีลักพาตัวอาร์มสตรอง ขณะปัวโรคุยกับแมรี เดเบแนม เขาถูกดร. อาร์บุธนอตยิงก่อนที่บุคจะมาช่วยไว้ได้

ปัวโรรวบรวมข้อมูลทั้งหมดแล้วเสนอออกมาเป็น 2 ทฤษฎี หนึ่งคือมีฆาตกรปลอมตัวเป็นพนักงานรถไฟเข้ามาฆ่าแรตเช็ตต์ก่อนจะหลบหนีไป สองคือผู้โดยสารทุกคนเป็นฆาตกร เพราะต่างได้รับผลกระทบจากคดีลักพาตัวอาร์มสตรองทั้งสิ้น โดยมาสเตอร์แมนเคยร่วมรบกับจอห์นก่อนจะมาเป็นพ่อบ้านตระกูลอาร์มสตรอง, ดร. อาร์บุธนอตเคยเป็นพลแม่นปืนใต้บังคับบัญชาของจอห์น เขาจงใจยิงให้ปัวโรบาดเจ็บเพื่อปกป้องแมรี คนรักของเขาให้พ้นจากข้อกล่าวหา, เคาน์เตสอันเดรนยี (ชื่อเดิม เฮเลนา โกลเดนเบิร์ก) ภรรยาของเคานต์อันเดรนยีเป็นน้องสาวของโซเนียและน้าของเดซี, เจ้าหญิงดราโกมิรอฟฟ์เป็นแม่ทูนหัวของโซเนีย, แมรีเคยเป็นผู้ดูแลเดซีและเธอคือผู้หญิงที่สวมชุดกิโมโนสีแดง, ชมิดท์เคยเป็นแม่ครัวตระกูลอาร์มสตรอง, มาร์เกซเป็นหนี้บุญคุณจอห์น เพราะเขาช่วยเหลือธุรกิจของมาร์เกซ, พีลาร์เคยเป็นพยาบาลของเดซี, บิดาของแม็คควีนเคยเป็นอัยการเขตที่ทำผิดพลาดด้วยการสั่งฟ้องซูซานในข้อหาฆ่าคนตาย, มิเชลเป็นพี่ชายของซูซาน, ฮาร์ดแมนเคยเป็นตำรวจที่คบหากับซูซานและตัวตนที่แท้จริงของคุณนายฮับบาร์ดคือ ลินดา อาร์เดน นักแสดงยอดฝีมือซึ่งเป็นแม่ของโซเนียและยายของเดซี เธอเป็นคนวางแผนทั้งหมด โดยให้ผู้โดยสารทุกคนยกเว้นเคาน์เตสอันเดรนยีซึ่งป่วยแทงแรตเช็ตต์จนตายแล้วทิ้งหลักฐานต่าง ๆ ไว้เพื่อให้ดูเหมือนว่ามีฆาตกรเพียงคนเดียว

เมื่อรถไฟกลับมาเดินทางอีกครั้ง ปัวโรตัดสินใจบอก "ทฤษฎีแรก" แก่ตำรวจด้วยเห็นว่าแรตเช็ตต์สมควรได้รับผลกรรมที่เขาก่อ ภาพยนตร์จบลงเมื่อปัวโรลงจากรถไฟที่สถานี ก่อนจะพบว่ามีผู้แจ้งข่าวว่าต้องการให้เขาไปสืบคดีฆาตกรรมบนเรือในแม่น้ำไนล์