ดร.นลินี ทวีสิน กรรมการผู้จัดการ สำนักพิมพ์ SuccessMedia (หนังสือคอมพิวเตอร์) ต่อมาได้รับเลือกตั้งเป็นสมาชิกวุฒิสภา กรุงเทพมหานคร ในการเลือกตั้ง พ.ศ. 2549 แต่ต้องถูกยกเลิกเนื่องจากการรัฐประหาร 19 กันยายน ต่อจากนั้นจึงได้ลงสมัครรับเลือกตั้ง ส.ส.กรุงเทพมหานคร สังกัดพรรคพลังประชาชน ในการเลือกตั้ง พ.ศ. 2550 แต่ไม่ได้รับเลือกตั้ง ต่อมาได้รับตำแหน่งที่ปรึกษารัฐมนตรีว่าการกระทรวงพาณิชย์ (มิ่งขวัญ แสงสุวรรณ์)

จากนั้นในการเลือกตั้ง พ.ศ. 2554 ได้ลงสมัครรับเลือกตั้งอีกครั้งในแบบบัญชีรายชื่อ สังกัดพรรคเพื่อไทย ลำดับที่ 125[8] แต่ไม่ได้รับเลือกตั้ง ต่อมาในการเลือกตั้งสมาชิกสภาผู้แทนราษฎรไทยเป็นการทั่วไป พ.ศ. 2557 เธอได้สมัครรับเลือกตั้งในระบบบัญชีรายชื่อ สังกัดพรรคเพื่อไทย ลำดับที่ 99[9]

ใน พ.ศ. 2561 นางนลินีได้ลาออกจากสมาชิกพรรค เพื่อไทย และย้ายมาสังกัด พรรคเพื่อธรรม พร้อมกับรับตำแหน่งรองหัวหน้าพรรคกระทั่งนาย สมพงษ์ อมรวิวัฒน์ ได้ลาออกจากการเป็นสมาชิกพรรคทำให้พ้นจากตำแหน่งหัวหน้าพรรค นางนลินีจึงได้รับเลือกให้ดำรงตำแหน่งหัวหน้าพรรคคนต่อมาก่อนที่จะลาออกจากสมาชิกพรรคทำให้พ้นจากตำแหน่งหัวหน้า พรรคเพื่อธรรม ในเวลาต่อมา [10] กระทั่งในเดือนกันยายน พ.ศ. 2562 เธอได้ลาออกจากตำแหน่งหัวหน้าพรรค[11]

รัฐบาลนางสาวยิ่งลักษณ์ ชินวัตร

ดร.นลินี ได้รับแต่งตั้งเป็นผู้แทนการค้าไทย ในรัฐบาลของนางสาวยิ่งลักษณ์ ชินวัตร เมื่อเดือนสิงหาคม พ.ศ. 2554[12] กระทั่งเมื่อวันที่ 18 มกราคม พ.ศ. 2555 ได้รับโปรดเกล้าฯ แต่งตั้งเป็นรัฐมนตรีประจำสำนักนายกรัฐมนตรี[13] กำกับดูแลสำนักงานปลัดสำนักนายกรัฐมนตรีเฉพาะสำนักงานเสริมสร้างเอกลักษณ์ของชาติ สำนักเลขาธิการนายกรัฐมนตรี เฉพาะสำนักโฆษกประจำสำนักนายกรัฐมนตรี ราชบัณฑิตยสถาน สำนักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ สำนักงานสภาที่ปรึกษาเศรษฐกิจและสังคมแห่งชาติ สำนักงานบริหารและพัฒนาองค์ความรู้ (องค์การมหาชน) สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย และ สำนักงานรับรองมาตรฐานและรับรองคุณภาพการศึกษา (องค์การมหาชน)[14] ต่อมาถูกปรับออกจากตำแหน่งในเดือนตุลาคม พ.ศ. 2555

ต่อมาเมื่อวันที่ 20 พฤศจิกายน พ.ศ. 2555 ได้รับแต่งตั้งเป็นผู้แทนการค้าไทย แทนนายวรวีร์ มะกูดี ที่ขอลาออกจากตำแหน่ง

กรณีติดบัญชีดำของสหรัฐอเมริกา

ภายหลังการได้รับแต่งตั้งเป็นรัฐมนตรี มีการเปิดเผยจากสถานเอกอัครราชทูตสหรัฐอเมริกา ประจำประเทศไทย ว่านลินี ทวีสิน มีชื่อติดอยู่ในบัญชีดำของสำนักงานควบคุมทรัพย์สินต่างชาติ กระทรวงการคลังสหรัฐอเมริกา เนื่องจากเป็น 1 ใน 3 นักธุรกิจที่ให้ความช่วยเหลือการทุจริตของรัฐบาลโรเบิร์ต มูกาเบ อดีตประธานาธิบดีซิมบับเว โดยนลินี ได้ทำธุรกิจร่วมกับภรรยาของโรเบิร์ต[15] แต่กรณีดังกล่าวได้รับการปฏิเสธจากนลินี ว่าเป็นเพียงความเข้าใจผิด และขอพิสูจน์ตนเองในโอกาสต่อไป[16]