พระเจ้าราชวรวงศ์เธอ พระองค์เจ้าขนิษฐา ประสูติเมื่อพ.ศ. 2341[1] เป็นพระราชธิดาในสมเด็จพระบวรราชเจ้ามหาเสนานุรักษ์ประสูติแต่เจ้าจอมมารดาสำลี พระราชธิดาในสมเด็จพระเจ้ากรุงธนบุรี มีพระเชษฐา พระเชษฐภคินีร่วมเจ้าจอมมารดา 6 พระองค์

ในสมัยรัชกาลที่ 4 พระองค์เจ้าขนิษฐาทรงร่วมกับพระองค์เจ้านัดดา บูรณะวัดบวรมงคลราชวรวิหารซึ่งเป็นวัดที่สมเด็จพระบวรราชเจ้ามหาเสนานุรักษ์ พระราชบิดาของทั้งสองพระองค์ทรงสถาปนาเป็นพระอารามหลวง ทั้งยังทรงสร้างกุฏิถวายพระสงฆ์เพื่อเป็นการอุทิศส่วนกุศลแด่เจ้าจอมมารดาสำลี พระมารดาด้วย[2]

พระเจ้าราชวรวงศ์เธอ พระองค์เจ้าขนิษฐา สิ้นพระชนม์ในรัชกาลที่ 5 เมื่อวันพฤหัสบดีที่ 4 มกราคม พ.ศ. 2419 พระชันษา 79 ปี พระราชทานเพลิงพระศพ ณ พระเมรุวัดสุวรรณาราม เมื่อวันที่ 29 พฤษภาคม พ.ศ. 2420[1]