วันที่ 18 เมษายน พ.ศ. 2541 พระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัวภูมิพลอดุลเดช ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้สมเด็จพระบรมโอรสาธิราชฯ สยามมกุฎราชกุมาร เสด็จพระราชดำเนินแทนพระองค์ไปทรงวางศิลาฤกษ์ “มหาวิทยาลัยมหิดล ณ กาญจนบุรี” (ในขณะนั้น) ณ หมู่บ้านไตรรัตน์ ตำบลลุ่มสุ่ม อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี

เมื่อวันที่ 20 มิถุนายน พ.ศ. 2538 คณะรัฐมนตรี ได้มีมติให้มหาวิทยาลัยมหิดลรับภารกิจในการจัดตั้งมหาวิทยาลัยมหิดล ณ กาญจนบุรี ในโครงการขยายการศึกษาขั้นอุดมศึกษาไปสู่ภูมิภาค มหาวิทยาลัยมหิดล จึงจัดตั้งโครงการจัดตั้งมหาวิทยามหิดล ณ กาญจนบุรี ขึ้นในสังกัดสำนักงานอธิการบดีในปี พ.ศ. 2538 ซึ่งจากการประสานงานระหว่าง รัฐมนตรีว่าการทบวงมหาวิทยาลัย ผู้แทนจังหวัดกาญจนบุรีและอธิการบดีมหาวิทยาลัยมหิดล ได้เห็นชอบที่จะให้มหาวิทยาลัยมหิดลขยายวิทยาเขตการศึกษาไปที่จังหวัดกาญจนบุรี โดยจังหวัดได้มีการแต่งตั้งคณะกรรมการการจัดหาที่ดินเพื่อเป็นที่ตั้งมหาวิทยาลัยขึ้นใหม่ เพื่อทำหน้าที่สำรวจ ตรวจสอบและศึกษา พื่นที่แปลงต่างๆ ที่เหมาะสม โดยได้เสนอพื้นที่ให้มหาวิทยาลัยพิจารณารวม 3 แห่ง คือ อำเภอห้วยกระเจา อำเภอพนมทวน และอำเภอไทรโยค

วันที่ 5 เมษายน พ.ศ. 2538 คณะกรรมการสภามหาวิทยาลัย และคณะผู้บริหารมหาวิทยาลัยมหิดลได้เดินทางไปสำรวจพื้นที่ที่จังหวัดเสนอไว้ทั้ง 3 แห่ง และมหาวิทยาลัยมหิดลได้มีมติให้เลือกพื้นที่บริเวณอำเภอไทรโยค ซึ่งตั้งอยู่ที่บ้านไตรรัตน์ หมู่ที่ 9 ตำบลลุ่มสุ่ม อำเภอโทรโยค เนื้อที่ประมาณ 6,000 ไร่ และบางส่วนอยู่ติดกับทางหลวงแผ่นดิน หมายเลข 323 (กาญจนบุรี – ทองผาภูมิ) เป็นสถานที่ตั้งมหาวิทยาลัยมหิดล ณ กาญจนบุรี

เมื่อวันที่ 1 ธันวาคม พ.ศ. 2540 มหาวิทยาลัยมหิดล ได้เริ่มก่อสร้างอาคารเรียนรวมและอาคารอำนวยการขึ้นเป็นจุดแรกของพื้นที่ก่อสร้าง ซึ่งเป็นภาพความทรงจำและความภาคภูมิใจ ที่ชาวจังหวัดกาญจนบุรี และบุคลากรที่เข้ามามีส่วนร่วมในการเริ่มก่อตั้งมหาวิทยาลัยมหิดล ณ กาญจนบุรี เป็นที่ดินในเขตปฏิรูปที่ดิน อำเภอไทรโยค สภาพเป็นที่ราบสูงและภูเขา เป็นที่ดินจำนวน 58 แปลงเนื้อที่ประมาณ 4,000 ไร่ นอกจากนี้เพื่อให้มหาวิทยาลัยมีสถานที่สวยงานสำหรับการประชุมและสัมมนา ชาวจังหวัดกาญจนบุรียังได้จัดซื้อที่ดินติดริมแม่น้ำแควน้อย ในเขตสุขาภิบาลลุ่มสุ่ม อำเภทโทรโยค จำนวน 24 ไร่ 1 งาน 67 ตารางวา มอบให้แก่มหาวิทยาลัยอีกด้วย

วันที่ 20 พฤษภาคม พ.ศ. 2552 มีประกาศมหาวิทยาลัยมหิดล เรื่อง การจัดตั้งส่วนงานของมหาวิทยาลัยมหิดล พ.ศ. 2552 เพื่อให้การบริหารงานของมหาวิทยาลัยมหิดลมีความเหมาะสมและสอดคล้องกับพระราชบัญญัติมหาวิทยาลัยมหิดล พ.ศ. 2550 จึงได้ออกประกาศให้มหาวิทยาลัยมหิดล แบ่งส่วนงานออกเป็น 2 สำนักงาน 1 วิทยาเขต 17 คณะ 7 สถาบัน 5 วิทยาลัย 1 หอสมุดฯ โครงการจัดตั้งมหาวิทยาลัยมหิดล ณ กาญจนบุรี จึงยกฐานะเป็น มหาวิทยาลัยมหิดล วิทยาเขตกาญจนบุรี นับตั้งแต่บัดนั้นมาจนถึงปัจจุบัน [2]