วันต์โฮฟฟ์เป็นที่รู้จักจากความรู้ในด้านเคมีอินทรีย์ ใน พ.ศ. 1874 วันต์โฮฟฟ์ได้ตั้งสมมุติฐานไว้ว่า พันธะเคมีระหว่างคาร์บอนและอะตอมรอบข้างจะมุ่งตรงไปยังมุมของปิรามิดฐานสามเหลี่ยมที่ไม่สมมาตร[14][15] ซึ่งโครงสร้างสามมิตินี้เป็นโครงสร้างพื้นฐานของโมเลกุลไอโซเมอร์ที่พบเจอทั่วไปในธรรมชาติ วันต์โฮฟฟ์ได้กล่าวชื่นชมถึงนักเคมีชาวฝรั่งเศส Joseph Achille Le Bel ซึ่งได้ตีพิมพ์วารสารที่มีแนวคิดเดียวกันกับของวันต์โฮฟฟ์เป็นภาษาฝรั่งเศส

สามเดือนก่อนที่วันต์โฮฟฟ์จะได้ส่งวิทยานิพนธ์ระดับปริญญาเอก (เรื่อง ผลงานเพื่อความรู้เกี่ยวกับกรด cyanoacetic และกรด malonic) วันต์โฮฟฟ์ตีพิมพ์ทฤษฎีโครงสร้างพันธะเคมีของอะตอมคาร์บอนเป็นภาษาดัตช์ในรูปแบบจุลสารเป็นครั้งแรกเมื่อ ค.ศ. 1874 โดยจุลสารนี้ประกอบไปด้วยข้อความสิบสองหน้าและไดอะแกรมหนึ่งหน้า วันต์โฮฟฟ์ได้ตีพิมพ์ทฤษฎีนี้เป็นอีกครั้งในปีต่อมาเป็นภาษาฝรั่งเศสที่มีหัวเรื่องว่า La chimie dans l'espace (Chemistry in Space) ถึงกระนั้น วันต์โฮฟฟ์และ Le Bel ยังเป็นนักเคมีที่มีอายุน้อย ซึ่งทำให้ทฤษฎีโครงสร้างพันธะเคมีนี้ถูกเพิกเฉยโดยวงการวงการวิทยาศาสตร์และถูกวิพากษ์อย่างเชือดเฉือนโดยนักเคมีชื่อดัง Hermann Kolbe[16] ผู้ได้กล่าวไว้ว่า:

"เป็นที่ปรากฏชัดว่าศาตราจารย์วันต์โฮฟฟ์แห่งวิทยาลัยสัตวแพทย์ยูเทรกต์ ไม่มีความชอบที่จะทำการศึกษาวิจัยในทางเคมีให้ถูกต้องแม่นยำ เขาคิดว่ามันง่ายกว่าที่จะขี่เพกาซัส (ยืมจากวิทยาลัยสัตวแพทย์ที่ วันต์โฮฟฟ์สอน) และประกาศอย่างที่เขากล่าวไว้ใน La chimie dans l’espace บนทางไปสู่ยอดเขาพาร์แนสซัสทางเคมี ว่าเขาเห็นอะตอมจัดเรียงอยู่ในห้วงอวกาศ"

จนกระทั่งใน ค.ศ. 1877 เมื่อทฤษฎีนี้ได้ถูกตีพิมพ์อีกรอบเป็นภาษาเยอรมัน วงการวิทยาศาสตร์ให้ความสนใจกับทฤษฎีนี้มากขึ้น และประมาณ ค.ศ. 1880 บุคคลในวงการนักเคมีสำคัญเช่น Johannes Wislicenus และ Viktor Meyer ได้สนับสนุนทฤษฎีนี้ ใน ค.ศ. 1905 ทฤษฎีโครงสร้างพันธะเคมีของวันต์โฮฟฟ์เป็นที่ยอมรับอย่างกว้างขวางโดยนักวิทยาศาสตร์นานาชาติ[16]

ใน ค.ศ. 1884 วันต์โฮฟฟ์ตีพิมพ์งานวิจัยเรื่องจลนพลศาสตร์เคมีซึ่งมีชื่อว่า Études de Dynamique chimique (การศึกษาเกี่ยวกับกลไกของปฏิกิริยาเคมี) ซึ่งในรายงานนี้วันต์โฮฟฟ์ได้เขียนถึงวิธีใหม่ในการกำหนดอันดับของปฏิกิริยาโดยใช้กราฟิกและใช้กฎของอุณหพลศาสตร์ในสมดุลเคมี นอกจากนี้แล้ว วันต์โฮฟฟ์ได้แนะนำแนวคิดในปัจจุบันของความคล้ายคลึงทางเคมี ใน ค.ศ. 1886 วันต์โฮฟฟ์แสดงให้เห็นถึงความคล้ายคลึงกันของพฤติกรรมของสารละลายเจือจางและก๊าซ ใน ค.ศ. 1887 วันต์โฮฟฟ์และนักเคมีชาวเยอรมัน Wilhelm Ostwald ได้ก่อตั้งนิตยสารเชิงวิทยาศาสตร์ชื่อว่า Zeitschrift für Physikalische Chemie (วารสารเคมีฟิสิกส์) วันต์โฮฟฟ์ศึกษาเกี่ยวกับทฤษฎีการแยกตัวของอิเล็กโทรไลต์ที่คิดค้นโดยสวานเต อาร์เรเนียส และให้หลักฐานเพื่อยืนยันการใช้งานของสมการอาร์เรเนียสใน ค.ศ. 1889 วันต์โฮฟฟ์ได้รับงานเป็นศาสตราจารย์ที่สถาบันวิทยาศาสตร์ปรัสเซียน ณ กรุงเบอร์ลินใน ค.ศ. 1896 การศึกษาเกี่ยวกับการตกตะกอนของเกลือที่วันต์โฮฟฟ์ ณ Staßfurt ถือว่าเป็นส่วนร่วมที่สำคัญในอุตสาหกรรมเคมีของปรัสเซีย

วันต์โฮฟฟ์ได้รับงานเป็นวิทยากรด้านเคมีและฟิสิกส์ที่ที่วิทยาลัยสัตวแพทย์ในเมืองยูเทรกต์ หลังจากนั้นแล้ว วันต์โฮฟฟ์จึงได้รับงานเป็นศาสตราจารย์ด้านเคมีวิทยา แร่วิทยา และธรณีวิทยาที่มหาวิทยาลัยอัมสเตอร์ดัมในระยะเวลา 18 ปีก่อนที่วันต์โฮฟฟ์ได้เป็นหัวหน้าแผนกวิชาเคมี ใน ค.ศ. 1896 วันต์โฮฟฟ์ได้ยอมรับคำเชิญไปยังกรุงเบอร์ลินเพื่อเป็นศาสตราจารย์กิตติมศักดิ์และสมาชิกของสถาบันวิทยาศาสตร์ปรัสเซียน โดยเหตุผลหลักสำหรับการตัดสินใจนี้เป็นเพราะว่าในสถาบันวิทยาศาสตร์ปรัสเซียน วันต์โฮฟฟ์ต้องให้การบรรยายเนื้อหาเรียนให้แก่นักศึกษาเพียงแค่หนึ่งชั่วโมงต่อสัปดาห์ซึ่งแตกต่างกับตอนที่ วันต์โฮฟฟ์ได้ทำงานอยู่ในมหาวิทยาลัยอัมสเตอร์ดัมซึ่งให้ภาระแก่ วันต์โฮฟฟ์เป็นอย่างมาก เช่น การบรรยาเนื้อหาเรียนพื้นฐานที่น่าเบื่อและประเมินผลนักศึกษาเป็นจำนวนมากซึ่งรวมถึงนักศึกษาแพทย์ เพราะเหตุเหล่านี้ทำให้วันต์โฮฟฟ์ไม่มีเวลาในการทำงานวิจัยเป็นของตัวเอง ใน ค.ศ. 1901 วันต์โฮฟฟ์ได้รับรางวัลโนเบลในสาขาเคมีเป็นครั้งแรก โดยงานที่ทำให้วันต์โฮฟฟ์ได้รับรางวัลคือการคิดค้นกฎของความดันออสโมซิสในสารละลาย และกฎของอัตราและกลไกการเกิดปฏิกิริยา วันต์โฮฟฟ์ทำงานอยู่ ณ กรุงเบอร์ลินจนถึงวันสิ้นชีวิต[16]