เมื่อวันอาทิตย์ที่ 24 พฤศจิกายน ออสวอลด์ถูกนำตัวผ่านชั้นล่างของกองบัญชาการตำรวจดัลลาสในการเตรียมเคลื่อนย้ายไปยังเรือนจำของเคาน์ตี เมื่อ เวลา 11.21 น. เจ้าของไนท์คลับดัลลาส แจ็ก รูบี ก้าวออกมาจากฝูงชนและยิงใส่ออสวอลด์ที่ท้อง ออสวอลด์เสียชีวิตเมื่อเวลา 13.07 น. ที่โรงพยาบาลอนุสรณ์พาร์คแลนด์ โรงพยาบาลเดียวกับที่เคนเนดีเสียชีวิตสองวันก่อน[38]

กล้องโทรทัศน์เครือข่ายกำลังออกอากาศสดอยู่ในขณะนั้น และผู้ชมหลายล้านคนเห็นภาพการยิงขณะที่เกิดขึ้น[39] เหตุการณ์ดังกล่าวยังมีถ่ายไว้จนเป็นภาพที่รู้จักกันดีอีกด้วย ภายหลังรูบีกล่าวว่า เขารู้สึกว้าวุ่นใจกับการถึงแก่อสัญกรรมของเคนเนดี และว่าเหตุจูงใจในการฆ่าออสวอลด์นั้นเป็นไปเพื่อ "... ช่วยมิให้คุณนายเคนเนดีสับสนจากการหวนกลับสู่ความเจ็บปวด"[40] หลายคนสันนิษฐานว่ารูบีเป็นส่วนหนึ่งของแผนสมคบคิด[41]