พระนางอิซาเบลประสูติที่เมืองมาดริกัลเดลัสอัลตัสตอร์เรส ประเทศสเปน ในวันที่ 22 เมษายน พ.ศ. 1994 หลังจากนั้น 3 ปี พระอนุชา คือ เจ้าชายอัลฟอนโซแห่งอัสตูเรียสได้ประสูติตามมา เมื่อพระเจ้าฆวนที่ 2 แห่งกัสติยา พระบิดา เสด็จสวรรคตในปี พ.ศ. 1997 พระเจ้าเอนริเกที่ 4 แห่งกัสติยา พระเชษฐาต่างพระมารดา ได้ขึ้นครองราชสมบัติ พระองค์ได้เนรเทศพระนางและพระอนุชาไปที่เมืองเซโกเบียและเนรเทศพระมารดาของพระนางอิซาเบลคือ สมเด็จพระราชินีอิซาเบลไปที่เมืองอาเรบาโล การสมรสครั้งแรกของพระเจ้าเอนริเก (สมรสกับสมเด็จพระราชินีบรานซ์แห่งนาวาร์) ไม่ค่อยราบรื่น จากนั้นได้สมรสกับสมเด็จพระราชินีฌูอานาแห่งโปรตุเกส พระเจ้าเอนริเกถูกกล่าวหาว่าทรงเป็นผู้รักร่วมเพศ พระนางฌูอานาได้ให้กำเนิดพระธิดาคือเจ้าหญิงฆัวนาแห่งกัสติยา เมื่อพระนางอิซาเบลมีพระชนมายุได้ 10 พรรษา พระนางและพระอนุชาได้ถูกเรียกตัวมาที่พระราชสำนักเพื่อให้อยู่ใต้การคุมพระองค์เข้มงวดขึ้น เหล่าขุนนางได้เรียกร้องให้พระเจ้าเอนริเกตั้งเจ้าชายอัลฟอนโซเป็นรัชทายาท พระองค์ก็ทรงยินยอมโดยให้เจ้าชายสมรสกับบุตรีของพระองค์ แต่ไม่กี่วันพระองค์ก็เปลี่ยนพระทัย

เหล่าขุนนางภายใต้เจ้าชายอัลฟอนโซได้เรียกร้องให้เจ้าชายทวงพระราชบัลลังก์คืน และได้สู้รบกับพระเจ้าเอนริเกในยุทธการที่โอลเมโด พ.ศ. 2010 ผลการสู้รบเสมอกัน 1 ปีให้หลังเจ้าชายอัลฟอนโซได้สิ้นพระชนม์ลงด้วยพระชันษา 14 ชันษา และเจ้าหญิงอิซาเบลก็ได้กลายเป็นความหวังสุดท้ายของเหล่าขุนนางฝ่ายเจ้าชายอัลฟอนโซ แต่พระนางปฏิเสธที่จะบัญชาการ ในที่สุดพระเจ้าเอนริเกที่ 4 ยินยอมให้เจ้าหญิงอิซาเบลเป็นทายาทครองราชบัลลังก์อย่างแท้จริง และหลังจากนั้นเจ้าหญิงฆัวนาจึงเป็นต้นตระกูลของพระราชบิดาต่อมา ใน พ.ศ. 2018 เจ้าหญิงฆัวนาได้สมรสกับพระปิตุลาของพระนางเองซึ่งเป็นกษัตริย์แห่งโปรตุเกส แต่การสมรสนี้ในภายหลังถูกสมเด็จพระสันตะปาปาห้ามเพราะเป็นการสมรสกันในเครือญาติ พระเจ้าเอนริเกยินยอมให้เจ้าหญิงอิซาเบลเลือกคู่สมรสของพระนางเอง พระนางได้เลือกเจ้าชายเฟร์นันโดรัชทายาทในราชบัลลังก์แห่งอารากอน พระนางทรงประทับใจในรูปโฉมของเจ้าชาย และเจ้าชายก็ทรงประทับใจพระนางเช่นกัน ทั้งสองพระองค์ได้อภิเษกสมรสกันในวันที่ 19 ตุลาคม พ.ศ. 2012 ที่เมืองบายาโดลิด