พระนางแมรีประสูติเมื่อวันที่ 7 หรือ 8 ธันวาคม ปี 1542 ณ พระราชวังลินลิธโกว ประเทศสก็อตแลนด์ แแต่พระเจ้าเจมส์ที่ 5 และพระชายาชาวฝรั่งเศส มารีแห่งกีซ (Mary de Guise) พระนางแมรีเป็นทายาทเพียงคนเดียวของพระราชบิดาที่มีชีวิตอยู่หลังพระเจ้าเจมส์เสด็จสวรรคต พระนางเป็นหลานย่าของ มาร์กาเร็ต ทิวดอร์ ผู้ทรงเป็นพระเชษฐภคินีในพระเจ้าเฮนรีที่ 8 แห่งอังกฤษ ฯ พระนางแมรีกลายเป็นสมเด็จพระราชินีแห่งสก็อตแลนด์เพียงหกวันหลังพระนางประสูติ เมื่อพระราชบิดาของพระนางทรงเสด็จสวรรคตในวันที่ 14 ธันวาคม 1542 เนื่องจากพระอาการประชวรหลังการรบที่สมรภูมิโซลเวย์มอส

ตำนานเล่าว่าขณะที่พระเจ้าเจมส์ทรงประชวรใกล้จะเสด็จสวรรคตนั้น ได้ทรงทราบว่าพระชายาได้ให้กำเนิดพระราชธิดา ก็ทรงอุทานว่า "มันเกิดมาแต่หญิง มันก็จะฉิบหายไปกับผู้หญิง!" ซึ่งสะท้อนว่าราชวงศ์สจ็วตของพระองค์ขึ้นครองราชย์ผ่านการอภิเสกสมรสกับหญิงสูงศักดิ์ (มาร์ยอรี บรูซ ธิดาของ พระเจ้าโรเบิร์ตที่ 1 แห่งสก็อตแลนด์) เมื่อราชสมบัติมาสู่ตระกูลของพระองค์ผ่านสตรี ก็ทรงทำนายว่าราชสมบัติจะสิ้นสุดไปกับสตรีดุจเดียวกัน อย่างไรก็ดีคำทำนายนี้ไม่ได้เป็นจริงในรัชสมัยของพระนางแมรี เพราะราชวงศ์สจวตคงอยู่สืบต่อมาจนสิ้นรัชสมัยของสมเด็จพระราชินีแอนน์

ในขณะที่ยังทรงเป็นทารก สก็อตแลนด์ถูกปกครองโดยผู้แทนพระองค์ ซึ่งมีการแย่งชิงอำนาจกันระหว่างเดวิด บีตัน ผู้เป็นคาร์ดินัลของนิกายคาทอลิค กับเจมส์ แฮมิลตัน เอิร์ลแห่งอาร์ราน (Earl of Arran) โดยแฮมิลตัน หรือเอิร์ลแห่งอาร์รานสามารถขึ้นสู่อำนาจได้จากการใช้เส้นสายในพระราชสำนักและคงเป็นผู้แทนพระองค์อยู่จน ปี 1554