สเปคติโนมัยซินออกฤทธิ์ยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนของเซลล์แบคทีเรีย โดยจะเข้าจับกับหน่วยย่อย 30 เอสของไรโบโซมของแบคทีเรีย ทำให้เกิดการแปรรหัสพันธุกรรมที่ผิดพลาด และส่งผลให้โปรตีนที่ได้จากการสังเคราะห์โปรตีนนี้มีลำดับกรดอะมิโนที่ผิดเพี้ยนไป ซึ่งจะไม่สามารถทำงานได้ ส่งผลให้เซลล์แบคทีเรียนั้นๆตายในที่สุด[1] การดื้อต่อยาสเปคติโนมัยซินนั้นพบรายงานการเกิดขึ้นในเชื้อแบคทีเรีย Pasteurella multocida โดยเกิดการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง S5 ของหน่วยย่อย 16 เอสของไรโบโซม[5]