ชีวสังเคราะห์ของสเปคติโนมัยซินนั้นมีความคล้ายคลึงกันกับยาอื่นในกลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ โดยเริ่มต้นจากการสร้างวงอิโนซิตอล (inositol ring) เช่นเดียวกัน จากนั้นกระบวนการต่างๆจะแตกต่างกันออกไปจนได้ผลิตภัณฑ์สุดท้ายเป็นสเปคติโนมัยซิน (ตามภาพประกอบ) โดยขั้นแรกของกระบวนนี้จะเป็นการรีดิวซ์ glucose-6-phosphate (1a) ด้วย NADH เป็นสารประกอบคีโตนที่ตำแหน่ง C2 (2a) จากนี้สารประกอบคีโตนที่ได้จะถูกเปลี่ยนเป็นสารประกอบเอมีนปฐมภูมิ (primary amine group) โดยเอนไซม์ PLP และ glutamine transamination (3a) โดยกระบวนการนี้จะเกิดขึ้นซ้ำอีกที่ตำแหน่ง C4 เพื่อสร้างเอมีนปฐมภูมิตำแหน่งที่ 2 (4a) เมื่อได้หมู่เอมีนทั้งสองตำแหน่งแล้ว วงแหวนกลูโคสนี้จะถูกเติมหมู่เมธิล (methylation) จนได้เป็น S-adenosyl methionine จำนวน 2 โมเลกุล (5a) จากปฏิกิรยาการเติมหมู่เมธิลนี้จะทำให้วงกลูโคสนั้นสามารถเปลี่ยนไปเป็นวงอิโนซิตอล (inositol ring) ได้โดยใช้อาศัยเอนไซม์ inositol cyclase (6a) เพื่อทำให้เกิดการไฮโดรไลซ์ที่จะกำจัดหมู่ฟอสเฟตออกไป จนได้ผลิตภัณฑ์สุดท้ายของขั้นตอนนี้เป็นวงอิโนซิตอลที่จะใช้เป็นส่วนหนึ่งสำหรับการสังเคราะห์สเปคติโนมัยซินในขั้นตอนถัดไป (7a)[6]

การสังเคราะห์โมเลกุลที่เป็นส่วนประกอบที่ 2 ของสเปคติโนมัยซินนั้นใช้สารตั้งต้นชนิดเดียวกันกับในขั้นตอนแรก คือ glucose-1-phosphate (1b) ซึ่งจะถูกเปลี่ยนเป็น TDP glucose โดยเอนไซม์ TDP synthase (2b) จากนั้น TDP glucose ที่เกิดขึ้นนี้จะถูกดึงหมู่ไฮดรอกซิลออกที่ตำแหน่ง C6 โดยเอนไซม์ hydratase enzyme (3b) แล้วถูกรีดิวซ์ต่อด้วย NADH ที่ตำแหน่ง C4 จนได้เป็นสารประกอบคีโตน (4b) จากนั้น PLP และ glutamine จะเปลี่ยนสารประกอบคีโตนดังกล่าวไปเป็นสารประกอบเอมีนปฐมภูมิ (primary amine group) (5b) ถัดจากนั้นหมู่เอมีนที่เกิดขึ้นจะถูกดึงออกไปจากโมเลกุลโดยเอนไซม์ deaminase (6b) ในกระบวนการสร้างสารในภาพ 6b นี้จะมีการเกิดปฏิกิริยารีดักชันเกิดขึ้นอีก 2 ครั้งที่ตำแหน่ง C4 และ C3 โดยอาศัย NADH จำนวน 2 โมเลกุลในการเข้าทำปฏิกิริยา จนได้ผลิตภัณฑ์สุดท้ายเพื่อใช้ในการสังเคราะห์สเปคติโนมัยซิน[6]

โมเลกุลที่เกิดจากการสังเคราะห์ใน 2 ช่องทางดังข้างต้นจะเข้าทำปฏิกิรยากัน โดยการกำจัดหมู่ TDP แล้วเกิดปฏิกิริยากันจนได้ผลิตภัณฑ์สุดท้ายเป็นสเปคติโนมัยซิน[6]

สเปคติโนมัยซินเป็นสารกลุ่มอะมิโนไซคลิตอล ซึ่งมีความสัมพันธ์กันกับอะมิโนไกลโคไซด์ การผลิตสเปคติโนมัยซินในเชิงอุตสาหกรรมนั้นจะได้จากการบ่มเชื้อแบคทีเรีย Streptomyces spectabilis ส่วนในธรรมชาตินั้น สเปคติโนมัยซินสามารถสร้างได้จากจุลชีพหลายชนิด รวมไปถึงไซยาโนแบคทีเรียและพืชอีกหลายชนิด โดยส่วนที่ควบคุมการสร้างสเปคติโนมัยซินนี้มีชื่อว่า เอสพีซี โอเปอรอน (spc operon) จะอยู่ในจีโนม หรือพลาสโตม หรือพลาสมิด ซึ่งส่วนใหญ่ยีน 2–10 ชนิดที่อยู่ติดกัน ซึ่งความต่างของขนาดโอเปอรอนนี้เป็นผลมาจากมีการกำจัดยีนเก่าออกไป หรือมียีนภายในนิวเคลียส (nuclear gene) เข้ามาทำหน้าที่ในส่วนนั้นๆแทน โดยการผลิตสเปคติโนมัยซินโดยจุลชีพในธรรมชาตินั้นมีจุดประสงค์หลักเพื่อป้องกันตัวเองจากการถูกกินหรือทำลายโดยจุลชีพหรือพืชอื่น (antipredator adaptation)