หลอดทดลองถูกใช้อย่างแพร่หลายในหมู่นักเคมี เพื่อบรรจุ ผสม หรือ ให้ความร้อนแก่สารเคมีที่เป็นของแข็งหรือของเหลว โดยเฉพาะในการทดลองเชิงคุณภาพ (qualitative experiments) ก้นที่กลมและหลอดที่ตั้งตรง ให้ประโยชน์หลายด้าน เช่น ช่วยลดมวลที่สูญเสียเวลาเท ทำความสะอาดง่ายขึ้น และทำให้การเฝ้าดูสิ่งที่บรรจุอยู่ภายในได้ง่ายขึ้น หลอดที่ยาวและปากที่แคบช่วยลดการกระจายตัวของก๊าซและไอน้ำสู่สิ่งแวดล้อม

หลอดทดลองซึ่งบรรจุน้ำไว้จนเต็มยังสามารถนำไปคว่ำบนบีกเกอร์ที่เต็มไปด้วยน้ำเพื่อเก็บกักก๊าซ เช่น ในการสาธิตการแยกหรือสกัดสารเคมีด้วยกระแสไฟฟ้า (electrolysis) นอกจากยังมีหลอดทดลองขนาดใหญ่สำหรับต้มของเหลวโดยเฉพาะซึ่งเรียกว่า boiling tube

โดยปกติแล้วหลอดเพาะเชื้อจะถูกใช้ในชีววิทยาเพื่อเลี้ยงสิ่งมีชีวิตหลากหลายชนิด เช่น รา แบคทีเรีย ต้นอ่อน เนื้อเยื่อพืช และ อื่นๆ โดยทางการแพทย์หลอดเพาะเชื้อยังถูกใช้เพื่อเก็บตัวอย่างเลือดหรือของเหลวอืน ๆ

นอกจากนี้บางทียังมีการใช้หลอดทดลองนอกห้องปฏิบัติการ เช่น ใช้เป็นแจกันใส่ดอกไม้หรือแม้แต่ใช้ใส่เครื่องปรุงอาหาร