อนงค์วรรณ เทพสุทิน เริ่มรับราชการครูเมื่อปี พ.ศ. 2524 ที่อำเภอสวรรคโลก จังหวัดสุโขทัย ต่อมาในปี พ.ศ. 2530 จึงได้โอนมาเป็นข้าราชการพลเรือนสามัญ สังกัดสำนักงานการประถมศึกษาจังหวัดสุโขทัย และในปี พ.ศ. 2538 จึงได้ย้ายเข้ามาปฏิบัติราชการ ในสังกัดกลุ่มช่วยอำนวยการและประสานราชการ สำนักงานปลัดกระทรวงศึกษาธิการ และลาออกจากราชการในปี พ.ศ. 2544 เพื่อลงสมัครรับเลือกตั้ง