อนงค์วรรณ เทพสุทิน เข้าสู่งานการเมืองในปี พ.ศ. 2544 เป็นสมาชิกสภาผู้แทนราษฎรครั้งแรก ในเขต 1 จังหวัดสุโขทัย สังกัดพรรคไทยรักไทย ต่อมาในปี พ.ศ. 2548 ได้รับการเลือกตั้งเป็นสมาชิกสภาผู้แทนราษฎร เขต 1 จังหวัดสุโขทัย สมัยที่ 2 และเป็นประธานชมรม ส.ส.หญิงพรรคไทยรักไทยด้วย ต่อมาก่อนการเลือกตั้ง พ.ศ. 2550 จึงได้ย้ายมาสังกัดพรรคประชาราช และได้รับตำแหน่งเลขาธิการพรรค แต่เกิดความขัดแย้งภายในพรรค จึงได้แยกตัวออกมาจัดตั้งพรรคการเมือง คือ พรรคมัชฌิมาธิปไตย และรับตำแหน่งหัวหน้าพรรค

ในปี พ.ศ. 2551 ได้รับการแต่งตั้งเป็นรัฐมนตรีว่าการกระทรวงทรัพยากรธรรมชาติและสิ่งแวดล้อม ในรัฐบาลของนายสมัคร สุนทรเวช และนายสมชาย วงศ์สวัสดิ์[2] แต่ต้องพ้นจากตำแหน่งเนื่องจากถูกตัดสิทธิ์ทางการเมืองเป็นเวลา 5 ปี ในคดียุบพรรคการเมือง พ.ศ. 2551[3]คณะกรรมการป้องกันและปราบปรามการทุจริตแห่งชาติ แจ้งข้อกล่าวหาว่า อนงค์วรรณ เทพสุทิน กระทำความผิดฐานทุจริตต่อหน้าที่ หรือกระทำความผิด ต่อตำแหน่งหน้าที่ราชการเกี่ยวกับโครงการอนุรักษ์ ทรัพยากรดินและป่าไม้ในพื้นที่ป่าอนุรักษ์ เพื่อลดผลกระทบ ภาวะวิกฤติโลกร้อน วงเงินงบประมาณปี 2551 จำนวน 770 บ้านบาท กรณีการก่อสร้างฝายต้นน้ำ แบบผสมผสานและการเพาะชำ/ปลูกหญ้าแฝก โดยมิชอบ และหักเงินโครงการดังกล่าว เพื่อประโยชน์ สำหรับตนเองและผู้อื่นโดยมิชอบ ทำให้เกิดความเสียหาย แก่ทางราชการ จำนวน 4 คดี [4]