พ.ศ. 2539 เข้าสู่วงการการเมืองโดยการรับตำแหน่ง ที่ปรึกษารัฐมนตรีว่าการกระทรวงการต่างประเทศ (ประจวบ ไชยสาส์น) และดำรงตำแหน่งรัฐมนตรีช่วยว่าการกระทรวงสาธารณสุข (พ.ศ. 2547 และ พ.ศ. 2548) และรัฐมนตรีช่วยว่าการกระทรวงพาณิชย์ (พ.ศ. 2547) ต่อมาถูกตัดสิทธิทางการเมืองเป็นเวลา 5 ปี เนื่องจากเป็นกรรมการบริหารของพรรคไทยรักไทย

เขาได้สมัครเข้าเป็นสมาชิกพรรคภูมิใจไทย ในปี พ.ศ. 2555 หลังจากพ้นกำหนดการตัดสิทธิทางการเมือง และได้รับเลือกตั้งเป็นหัวหน้าพรรคภูมิใจไทย เมื่อวันที่ 14 ตุลาคม พ.ศ. 2555[7]

ในการเลือกตั้งสมาชิกสภาผู้แทนราษฎรไทยเป็นการทั่วไป พ.ศ. 2557 เขาได้สมัครรับเลือกตั้งในระบบบัญชีรายชื่อ สังกัดพรรคภูมิใจไทย ลำดับที่ 1[8] แต่การเลือกตั้งเป็นโมฆะ

ในการเลือกตั้งสมาชิกสภาผู้แทนราษฎรไทยเป็นการทั่วไป พ.ศ. 2562 เขาได้รับเลือกตั้งในระบบบัญชีรายชื่อ[9] สังกัดพรรคภูมิใจไทย ลำดับที่ 1 และได้รับการเสนอชื่อให้เป็นบุคคลที่พรรคการเมืองจะเสนอชื่อต่อรัฐสภาให้เป็นนายกรัฐมนตรี

หลังการเลือกตั้ง พ.ศ. 2562 นายอนุทิน และพรรคภูมิใจไทย ได้เข้าร่วมกับพรรคพลังประชารัฐ จัดตั้งรัฐบาล โดยเขาได้รับแต่งตั้งเป็นรองนายกรัฐมนตรี และรัฐมนตรีว่าการกระทรวงสาธารณสุข