อินเตอร์สเตต 65 (อังกฤษ: Interstate 65 หรือ I-65) เป็นทางหลวงอินเตอร์สเตตสายหลักในภูมิภาคสหรัฐกลาง หมายเลขลงท้ายด้วย 5 หมายความว่ามีเส้นทางในแนวเหนือ–ใต้ เชื่อมต่ออ่าวเม็กซิโกกับเกรตเลกส์เข้าด้วยกัน ปลายทิศใต้ตั้งอยู่ที่ทางแยกต่างระดับบนอินเตอร์สเตต 10 ในนครโมบีล รัฐแอละแบมา และมีปลายทิศเหนืออยู่ที่ทางแยกต่างระดับบนอินเตอร์สเตต 90 ทางหลวงสหรัฐหมายเลข 12 และทางหลวงสหรัฐหมายเลข 20 ในนครแกรี รัฐอินดีแอนา ทางตะวันออกเฉียงใต้ของนครชิคาโกอินเตอร์สเตต 65 เชื่อมต่อพื้นที่เมืองหลายแห่งในภูมิภาคสหรัฐตะวันตกกลางและสหรัฐใต้ ซึ่งเชื่อมต่อเมืองใหญ่ 4 แห่งในรัฐแอละแบมา ได้แก่ โมบีล มอนต์กอเมอรี เบอร์มิงแฮม และฮันต์สวิลล์ และยังเป็นหนึ่งในเส้นทางที่ผ่านเมืองแนวเหนือ–ใต้ของแนชวิลล์ รัฐเทนเนสซี, ลุยส์วิลล์ รัฐเคนทักกี, และอินเดียแนโพลิส รัฐอินดีแอนา