อีเซทิไมบ์ออกฤทธิ์ยับยั้งการดูดซึมคอเลสเตอรอลจากอาหารและน้ำดีเข้าสูแอนเทอโรไซต์ (enterocytes) ของลำไส้เล็ก[1][10][13] ทำให้ปริมาณคอเลสเตอรอลที่ส่งขนส่งไปยังตับลดน้อยลง ส่งผลให้ตับต้องดึงเอาคอเลสเตอรอลที่อยู่ในกระแสเลือดมาใช้ในกระบวนการการสร้างน้ำดีแทน การดึงเอาคอเลสเตอรอลจากกระแสเลือดมาใช้นี้จะทำให้ระดับของคอเลสเตอรอลในกระเลือดลดลงได้ในที่สุด[1][7] อย่างไรก็ตามอีเซทิไมบ์ไม่มีผลต่อการดูดซึมของไตรกลีเซอไรด์จึงมีฤทธิ์แตกต่างจากสารชนิดอื่นในกลุ่ม 2-azetidinones เช่น เอสซีเอช-48461 (SCH 48461) และ เอสซีเอช-53695 (SCH 53695) ที่ยับยั้งการดูดซึมไตรกลีเซอไรด์ นอกจากนี้ อีเซทิไมบ์ยังมีผลยับยั้งการดูดซึมสเตอรอลที่ได้จากพืช (plant sterols) อีเซทิไมบ์ออกฤทธิ์ลดระดับไขมันในเลือดโดยไม่จับกับน้ำดีและไม่มีผลต่อเอนไซม์ไลเปสจากตับอ่อน[1][13] โดยหากใช้อีเซทิไมบ์ร่วมกับยาลดไขมันกลุ่มสแตติน (Statins) จะทำให้ลดไขมันได้หลายตัวเช่น Total cholesterol, LDL-cholesterol, Non-HDL cholesterol, Apolipoprotein และ Triglyceride กับส่งผลให้เพิ่มไขมัน HDL-cholesterol ซึ่งเป็นไขมันดีต่อร่างกาย จากกลไกเหล่านี้ทำให้เกิดฤทธิ์ของการรักษาตามสรรพคุณดังที่กล่าวอ้างไว้ดังข้างต้น[14] อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์ยับยั้งการดูดซึมคอเลสเตอรอลของยาชนิดนี้ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด แต่คาดว่าอีเซทิไมบ์จะออกฤทธิ์ยับยั้งโปรตีนที่เป็นสารสื่อกลางสำคัญซึ่งทำหน้าที่เกี่ยวเนื่องกับกระบวนการการดูดซึมคอเลสเตอรอลที่มีชื่อว่า Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1) บนเซลล์เยื่อบุทางเดินอาหาร (Gastrointestinal tract epithelial cells) และในเซลล์ตับ (hepatocytes), ปิดกั้น aminopeptidase N ซึ่งทำหน้าที่ย่อยสารอาการจำพวกโปรตีน, และรบกวน Caveolin 1-Annexin A2 complex ซึ่งทำหน้าที่ในการขนส่งคอเลสเตอรอล[7]