เนื่องจากพื้นที่ของอุทยานส่วนใหญ่เป็นภูเขาลาดชัน เป็นเนินเขา สภาพป่าจึงประกอบด้วย

• ป่าเบญจพรรณ พันธุ์ไม้คละปะปนกันมาก เช่น ประดู่ มะค่าโมง แดง ชิงชัน ตะแบก มะเกลือ งิ้วป่า ฯลฯ พืชพื้นล่างมีหญ้าและไผ่ชนิดต่าง ๆ
• ป่าเต็งรัง มีต้นไม้ขนาดเล็กและขนาดกลางขึ้นอยู่กระจัดกระจาย พืชชั้นล่างมีหญ้าชนิดต่าง ๆ ขึ้นอยู่ทั่วไป โดยเฉพาะหญ้าแพ้ว พันธุ์ไม้ที่พบได้แก่ เต็ง รัง พยอม เขลง ตะคร้อ ฯลฯ
• ป่าดิบแล้ง พบบริเวณที่ราบเรียบหรือหุบเขา พันธุ์ไม้ที่พบได้แก่ ตะเคียน พยุง สมพง กระเบากลัก กัดลิ้น ข่อยหนาม ยาง กระบก ฯลฯ พืชพื้นล่างมีหวาย และพืชในตระกูลขิงข่าต่าง ๆ

สภาพป่าของป่าเขาพระวิหารและป่าฝั่งซ้ายลำโดมใหญ่บนทิวเขาพนมดงรักยังมีความอุดมสมบูรณ์ จึงมีสัตว์ป่านานาชนิดอาศัยอยู่ทั่วไป เช่น หมูป่า ลิงแสม พังพอนธรรมดา กระต่ายป่า หนูท้องขาว กระรอกหลากสี กระแตเหนือ ค้างคาวยอดกล้วยผีเสื้อ นกนางแอ่นลาย นกเขนน้อยปีกแถบขาว นกปรอดทอง นกแซงแซวหางบ่วงใหญ่ นกกินแมลงอกเหลือง นกปีกลายสก็อต จิ้งจกดินลายจุด ตุ๊กแกเขาหินทราย กิ้งก่าบินปีกสีส้ม จิ้งเหลนภูเขาเขมร ตะกวด งูดิน งูเหลือม งูแม่ตะงาว งูหัวกะโหลก กบหนอง เขียดจะนา กบหลังขีด กบนา ปาดบ้าน อึ่งข้างดำ และกบอ่อง เป็นต้น ในบริเวณพื้นที่แหล่งน้ำมีปลาหลากชนิดอาศัยอยู่ เช่น ปลากระสูบจุด ปลาตะเพียนทอง ปลานวลจันทร์เทศ ปลาช่อน ปลาหมอเทศ และปลาดุกด้าน เป็นต้น