รายการ เจาะใจ มีพิธีกรดำเนินรายการหลายท่าน ตามลำดับการเปลี่ยนแปลง ดังนี้

• พิธีกรคู่แรก คือ ดำรง พุฒตาล และ สัญญา คุณากร จนกระทั่งในปี พ.ศ. 2543 ได้มีการเปลี่ยนแปลงพิธีกรฝ่ายหนึ่ง โดยให้ สัญญา ดำเนินรายการคู่กับ นารากร ติยายน และ พ.ศ. 2548 เปลี่ยนเป็น ปิติ ภิรมย์ภักดี
• ในปี พ.ศ. 2550 คุณสัญญาได้ขอลาออกจากรายการนี้ เนื่องจากต้องไปทำรายการ ตาสว่าง ทางช่อง 9 ทำให้ทางรายการต้องเปลี่ยนพิธีกรคู่เป็น จอมขวัญ หลาวเพ็ชร์ และ ณัฐวุฒิ อมรวิวัฒน์ นอกจากนี้ทางรายการยังได้จัดโครงการช่วยเหลือสังคม ภายใต้แนวคิด "มีส่วนร่วม เพื่อส่วนรวม" โดยเพิ่มช่วงพิเศษ คือ ส่งความสุข มีพิธีกรเฉพาะช่วงคือ เชษฐวุฒิ วัชรคุณ และ พุทธชาติ พงศ์สุชาติ
• ในปี พ.ศ. 2552 มีพิธีกรดำเนินรายการเป็นชายล้วน 4 คน ได้แก่ ณัฐวุฒิ อมรวิวัฒน์, เชษฐวุฒิ วัชรคุณ, สุวิกรม อัมระนันทน์ และ สัญญา คุณากร ซึ่งกลับมาทำหน้าที่ดำเนินรายการนี้ ต่อมาเหลือพิธีกรเพียง 2 คน คือ สัญญา และ ณัฐวุฒิ เนื่องจากเวลาการออกอากาศลดลง
• ในปี พ.ศ. 2554 ณัฐวุฒิได้ขอลาออกจากรายการนี้[5] ทำให้พิธีกรเหลือเพียง สัญญา คุณากร และเพิ่มพิธีกรอีก 2 คน คือ วรรณสิงห์ ประเสริฐกุล และ เกรียง​ไกรมาศ พจนสุนทร (ดีเจเคนโด้)[6]
• ในปี พ.ศ. 2555 รายการเข้าสู่ปีที่ 21 จึงเหลือพิธีกรหลักเพียงคนเดียวคือ สัญญา คุณากร โดยมี วงศ์ทนง ชัยณรงค์สิงห์, ยุทธนา บุญอ้อม, สรกล อดุลยานนท์ และ วรรณสิงห์ ประเสริฐกุล มาเป็นผู้แลกเปลี่ยนมุมมองความคิดในรายการ [7] ส่งผลให้ สัญญา คุณากร ซึ่งเป็นพิธีกรหลักของรายการได้รับ รางวัลนาฏราช ถึง 4 ครั้ง นั่นคือ รางวัลนาฏราช ครั้งที่ 1 รางวัลนาฏราช ครั้งที่ 4 รางวัลนาฏราช ครั้งที่ 5 และ รางวัลนาฏราช ครั้งที่ 7