เทสโทสเตอโรนในมนุษย์และสัตว์มีกระดูกสันหลังอื่น ๆ ออกฤทธิ์ผ่านกลไกหลายอย่าง คือ ออกฤทธิ์ต่อตัวรับแอนโดรเจน (androgen receptor ตัวย่อ AR โดยตรงหรือโดยเป็น DHT) ซึ่งเป็นตัวรับในนิวเคลียส (nuclear receptor) และการแปรเป็น estradiol แล้วออกฤทธิ์ต่อตัวรับเอสโทรเจนบางอย่างทั้งในนิวเคลียสและบนเยื่อหุ้มเซลล์[143][144]แอนโดรเจนเช่นเทสโทสเตอโรนยังยึดและออกฤทธิ์ต่อ membrane androgen receptor ซึ่งเป็นตัวรับที่เยื่อหุ้มเซลล์ อีกด้วย[145][146][147]

เทสโทสเตอโรนที่เป็นอิสระ (T) จะส่งเข้าไปยังไซโทพลาซึมของเซลล์เป้าหมาย ที่มันสามารถเข้ายึดกับ AR แล้วรีดิวซ์เป็น 5α-dihydrotestosterone (DHT) โดยเอนไซม์ในไซโทพลาสซึมคือ 5α-reductaseและเพราะ DHT จะเข้ายึดกับ AR เดียวกันแรงยิ่งกว่าเทสโทสเตอโรน ดังนั้น จึงมีฤทธิ์ทางแอนโดรเจนมากกว่าถึง 5 เท่า ของ T[148]ตัวรับเทสโทสเตอโรนหรือคอมเพล็กซ์รับ DHT จะเปลี่ยนรูป ทำให้มันสามารถเข้าไปในนิวเคลียสของเซลล์ และเข้ายึดกับลำดับนิวคลีโอไทด์โดยเฉพาะ ๆ บนโครโมโซมของดีเอ็นเอจุดที่เข้ายึดเรียกว่า hormone response element (HREs) และมีอิทธิพลต่อการถอดรหัสยีนบางอย่าง ซึ่งเป็นผลที่ปรากฏของแอนโดรเจน

AR เกิดในระบบต่าง ๆ มากมายในร่างกายของสัตว์มีกระดูกสันหลัง และทั้งชายหญิงตอบสนองเช่นเดียวกันที่ฮอร์โมนระดับเดียวกันปริมาณเทสโทสเตอโรนที่ต่าง ๆ กันมากในช่วงก่อนคลอด ช่วงวัยเริ่มเจริญพันธุ์ และตลอดชีวิต สามารถอธิบายความแตกต่างระหว่างเพศของหญิงชายกระดูกและสมองเป็นเนื้อเยื่อสำคัญสองอย่างในมนุษย์ที่ผลหลักของเทสโทสเตอโรนจะเกิดผ่านกระบวนการ aromatization แล้วเปลี่ยนเป็น estradiolโดยในกระดูก estradiol จะเร่งให้กระดูกอ่อนเปลี่ยนเป็นกระดูกแข็ง ทำให้ epiphysis ปิดและถึงจุดอวสานของการเจริญเติบโตของกระดูก

ในระบบประสาทกลาง เทสโทสเตอโรนก็จะผ่านกระบวนการ aromatization แล้วเปลี่ยนเป็น estradiol เหมือนกันซึ่ง (ไม่ใช่เทสโทสเตอโรน) ทำหน้าที่เป็นสัญญาณป้อนกลับที่สำคัญที่สุดต่อไฮโปทาลามัส (โดยเฉพาะในการหลั่งฮอร์โมน luteinizing hormone)[149]ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมากมาย เอสโทรเจนที่ทำจากเทสโทสเตอโรนจะเป็นตัวทำบุรุษภาพของส่วนสมองที่ต่างกันระหว่างเพศ ทั้งในช่วงก่อนคลอดและใกล้ ๆ คลอด จึงเป็นตัวกำหนดพฤติกรรมทางเพศของชายต่อมา[150]