ปฏิกิริยาของเอนไซม์จะดำเนินไปได้อย่างไรนั้นขึ้นอยู่กับปัจจัยที่สำคัญ ดังนี้

1. อุณหภูมิ เอนไซม์แต่ละชนิด มีความไวต่ออุณหภูมิแตกต่างกัน อุณหภูมิที่เอนไซม์ทำงานได้ดีที่สุด (optimum temperature) โดยทั่วไปอยู่ประมาณ 25-40 องศาเซลเซียส ถ้าอุณหภูมิสูงเกินไปปฏิกิริยาจะลดลงทั้งนี้เพราะ เอนไซม์ซึ่งเป็นโปรตีนจะเกิดการเสียสภาพ (denature) จึงเข้ารวมกับซับสเตรตไม่ได้
2. ความเป็นกรดเป็นด่าง มีผลต่อปฏิกิริยาของเอนไซม์ เอนไซม์ แต่ละชนิดจะทำงานได้ดีที่สุด ในสภาวะที่มีความเป็นกรดเป็นด่างพอเหมาะ (optimum pH) ซึ่งอาจแตกต่างกัน เช่น ซูเครสทำงานได้ดีที่สุดที่ pH =6.2 ลิเพส =7.0 เพปชิน = 1.5-2.5 ทริปชิน =8-11
3. ปริมาณของเอนไซม์ ถ้ามีเอนไซม์มากจะทำให้ปฏิกิริยาเกิดขึ้น อย่างรวดเร็ว แต่ถ้าเอนไซม์มากเกินพอ ความเร็วของปฏิกิริยาจะไม่เพิ่มขึ้น ทั้งนี้เพราะ ไม่มีซับสเตรตเหลือพอที่จะเข้าทำปฏิกิริยา
4. ปริมาณซับสเตรต มีผลเช่นเดียวกับปริมาณของเอนไซม์คือถ้าเพิ่ม ซับสเตรตมากเกินไป ปฏิกิริยาก็จะไม่เกิดเร็วขึ้น เพราะปริมาณเอนไซม์มีไม่เพียงพอ

นอกจากปัจจัยทั้งสี่ที่กล่าวมาแล้วยังมีสารบางชนิดที่มีผลต่อการทำงานของเอนไซม์ เช่นสารที่ทำให้การทำงานของเอนไซม์ลดลง เรียกว่า ตัวยับยั้ง (inhibitor) ส่วนสาร ที่เร่งการทำงานของเอนไซม์ได้ดีขึ้น เรียกว่า ตัวเร่งเร้า (activator) ตัวยับยั้งบางตัวจะรวมกับเอนไซม์ที่แหล่งกัมมันต์ ทำให้เอนไซม์ไม่สามารถรวมกับ ซับสเตรตได้ ตัวยับยั้งแบบนี้เรียกว่าคอมเพทิทีฟอินฮิบิเตอร์ (competitive inhibitor) ซึ่งจะมีรูปร่างโมเลกุลคล้ายกับซับสเตรต