กรมศิลปากร รับโอนกิจการ โขน ละคร และดนตรี จากสำนักพระราชวัง มาดำเนินการตั้งแต่ปี พ.ศ. 2475 แต่เดิมยังไม่มีโรงละครแห่งชาติ มีแต่โรงแสดงของกรมศิลปากร ซึ่งเป็นหอประชุมเก่าของกรมศิลปากร เป็นอาคารสร้างด้วยไม้หลังคามุงด้วยสังกะสี ตั้งอยู่ด้านขวาของพระที่นั่งศิวโมกขพิมานอันเป็นส่วนหนึ่งของหอสมุดและพิพิธภัณฑสถานแห่งชาติ พระนคร พระเจ้าวรวงศ์เธอ พระองค์เจ้าภาณุพันธ์ยุคล ได้ปรับปรุงหอประชุมขึ้นใหม่ ต่อมาได้มีการเปลี่ยนชื่อจาก หอประชุมกรมศิลปากร เป็น "โรงละคอนศิลปากร" และเกิดเหตุเพลิงไหม้เมื่อวันที่ 9 พฤศจิกายน พ.ศ. 2503

โรงละครแห่งชาติ เริ่มสร้างในปีงบประมาณ พ.ศ. 2504 ถึง พ.ศ. 2508 โดยใช้งบประมาณค่าใช้จ่ายรวมเป็นเงินทั้งสิ้น 56,484,465 บาท โดยมี นายอิสสระ วิวัฒนานนท์ เป็นสถาปนิก และศาสตราจารย์ ดร.รชฎ กาญจนะวณิชย์ เป็นวิศวกรผู้ควบคุม ต่อมามีการดัดแปลงแก้ไข โดยมีหม่อมเจ้าสมัยเฉลิม กฤดากร เป็นสถาปนิกผู้แก้ไข โดยใช้งบประมาณจำนวน 41 ล้านบาท

เมื่อการก่อสร้างดำเนินมาได้ระยะหนึ่ง ทางคณะกรรมการก่อสร้างโรงละคร ได้กราบบังคมทูลเชิญเสด็จพระราชดำเนินไปทอดพระเนตรโรงละครแห่งชาติที่กำลังก่อสร้าง ซึ่งพระบาทสมเด็จพระปรมินทรมหาภูมิพลอดุลยเดช เสด็จพระราชดำเนินเมื่อวันที่ 9 มกราคม พ.ศ. 2507 และโปรดเกล้าพระราชทานพระบรมราชวินิจฉัยแนะนำแก้ไขเพิ่มเติมหลายประการ หลังจากนั้นโรงละครแห่งชาติแล้วเสร็จ และทำพิธีเปิดเป็นทางการได้ในวันที่ 23 ธันวาคม พ.ศ. 2508 โดยมี จอมพล ถนอม กิตติขจร นายกรัฐมนตรีเป็นผู้ประกอบพิธีเปิด

พระบาทสมเด็จพระปรมินทรมหาภูมิพลอดุลยเดช และ สมเด็จพระนางเจ้าฯ พระบรมราชินีนาถ ในรัชกาลที่ 9 ได้ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ เสด็จพระราชดำเนินทอดพระเนตรการแสดงนาฏศิลปไทยในวโรกาสพิธีเปิดโรงละครแห่งชาติ ในคืนวันที่ 23 ธันวาคม พ.ศ. 2508 ซึ่งได้มีการจัดแสดงรวม 3 ชุด คือ 1.รำดอกไม้เงินดอกไม้ทองถวายพระพร 2.การแสดงละครเรื่องสังข์ศิลป์ชัย ตอนชุบสังข์ศิลป์ชัย 3.โขนเรื่องรามเกียรติ์ ชุด รามาวตาร ซึ่งนับเป็นปฐมฤกษ์ของการดำเนินกิจการโรงละครแห่งชาติตั้งแต่นั้นเป็นต้นมา