การเกิดภาพของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนเริ่มต้นจากลำแสงเลเซอร์ผ่านช่องของแล่งกำเนิดแสงแบบจุดและถูกโฟกัสด้วยเลนส์วัตถุเป็นปริมาตรของจุดโฟกัส (focal volume) ภายในหรือบนพื้นผิวของชิ้นเนื้อตัวอย่าง แสงสะท้อนจากวัตถุถูกสะท้อนกลับมายังเลนส์วัตถุอีกครั้งโดยแสงสะท้อนนี้มีความยาวคลื่นแตกต่างจากแสงที่มาจากแหล่งกำเนิดแสงแบบจุด เมื่อแสงสะท้อนเดินทางมาถึงตัวแยกแสง (beam slitter) โดยตัวแยกแสงนี้มีคุณสมบัติคือจะยอมให้แสงความยาวคลื่นหนึ่งผ่านไปได้แต่จะสะท้อนแสงอีกความยาวคลื่นหนึ่ง โดยแสงที่สามารถผ่านไปได้จะเป็นแสงจากแหล่งกำเนิดแสงแต่แสงที่สะท้อนมาจากวัตถุจะถูกสะท้อนอีกครั้งหนึ่งเพื่อผ่านไปยังรูขนาดเล็กด้านตัวรับแสง ซึ่งรูขนาดเล็กนี้จะทำการกำจัดแสงที่ไม่ได้มาจากจุดโฟกัสทำให้ได้ภาพที่คมชัดกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบปกติ และสามารถเก็บภาพเฉพาะชั้นความลึกที่ต้องการเท่านั้น และในที่สุดจะเดินทางไปถึงตัวรับแสงแบบตัวคูณ (Photo Multiplier Tube; PMT) ซึ่งตัวรับแสงแบบตัวคูณจะทำหน้าที่แปลงสัญญาณแสงเป็นสัญญาณไฟฟ้า[4] โดยส่วนมากจะมีตัวกรองแสง (optical filter) ระหว่างรูขนาดเล็กกับตัวรับแสงเพื่อกรองแสงที่ไม่ต้องการออกอีกครั้งหนึ่งเพื่อให้ได้ภาพที่คมชัดขึ้น

จากที่กล่าวมาข้างต้นแสงที่ได้รับมาจากวัตถุนั้นเป็นแสงสะท้อนจากปริมาตรของจุดโฟกัส โดยแสงสะท้อนนั้นจะกลายเป็นพิกเซล (pixel) ในภาพที่เป็นผลลัพพ์สุดท้าย โดยความสว่างของภาพจะขึ้นอยู่กับความเข้มของสัญญาณแสงสะท้อน ดังนั้นหากเราต้องการภาพหนึ่งภาพ เราจะต้องทำการสแกนแบบจุดต่อจุดให้ทั่วทั้งบริเวณที่เราต้องการ แล้วนำสัญญาณแสงมาแปลงเป็นแต่ละพิกเซล ในการสแกนลำแสงเลเซอร์ให้ทั่วบริเวณที่เราต้องการภาพนั้น เราใช้กระจกที่สามารถปรับได้เพื่อสะท้อนลำแสงเลเซอร์ไปยังบริเวณที่ต้องการได้ ซึ่งการทำกระจกให้สามารถปรับได้นั้นอาจใช้มอเตอร์มาช่วยเพื่อควบคุมมุมของการสะท้อนของลำแสงเลเซอร์ วิธีการที่ใช้ในการสแกนลำแสงเลเซอร์โดยปกตินั้นเป็นวิธีการที่ตอบสนองช้าและสามารถปรับความเร็วได้ เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์จะเก็บแสงเฉพาะที่ปริมาตรของจุดโฟกัสเท่านั้นทำให้ต้องใช้เวลาในการเปิดหน้ากล้องนานกว่ากล้องแบบปกติ ดังนั้นการที่สแกนช้าจะส่งผลดีต่อภาพคือทำให้อัตราส่วนระดับสัญญาณแสงสะท้อนต่อสัญญาณรบกวน (signal-to-noise ratio) สูงขึ้น ส่งผลให้ความคมชัดและความละเอียดของภาพสูงขึ้น

การเก็บภาพที่ระดับความลึกต่างๆของวัตถุนั้นทำได้โดยการปรับความสูงของฐานของกล้องจุลทรรศน์หรือปรับระดับความสูงของเลนส์วัตถุเพื่อเปลี่ยนตำแหน่งของจุดโฟกัสให้ต่ำลงหรือสูงขึ้น เมื่อเราได้ภาพ 2 มิติ ที่ระดับความลึกต่างๆแล้ว เมื่อเรานำภาพต่างๆมาประกอบกันโดนเรียงเป็บชั้นๆเราจะได้ภาพโครงสร้างแบบ 3 มิติ[5]

กล้องจุลทรรน์แบบคอนโฟคอลนี้มีความสามารถในการตัดทางแสง (optical sectioning) ซึ่งทำให้ไม่จำเป็นที่จะต้องทำลายตัวอย่างเพื่อทำการศึกษาโครงสร้างภายใน และทำให้ลดระยะและการวางแผนสำหรับการทดสอบต่างๆ รวมทั้งทำให้ภาพถ่ายมีความละเอียดเพิ่มขึ้น[6] ชิ้นเนื้อตัวอย่างในงานชีววิทยานั้นปกติจะถูกย้อมด้วยสีย้อมของฟลูออเรสเซ็นต์ (fluorescent dye) สำหรับการสังเกตเฉพาะสิ่งที่ต้องการเท่านั้น อย่างไรก็ตามในความเป็นจริงความเข้มข้นของสีย้อมอาจถูกทำให้น้อยลงเพื่อลดการรบกวนในระบบ ดังนั้นกล้องหรือเครื่องมือวัดบางชนิดสามารถจับแสงฟลูออเรสเซ็นต์ได้เพียงโมเลกุลเดียว ดังนั้นจึงมีการใช้ transgenic techniques เพื่อที่จะสร้างโมเลกุลแบบฟลูออเรสเซ็นต์เสมือน (fluorescent chimeric molecules)ขึ้นมา เช่นการนำเอา Green Fluorescent Protein (GFP) มารวมกับโปรตีนชนิดที่เราสนใจในการสังเกตในงานชีววิทยา