เมนูนำทาง
การทดลองเชิงโมเลกุลเดี่ยว
เทคนิคการวัดการเคลื่อนไหวของโมเลกุลโดยตรง (Single-molecule manipulation technique) สนใจศึกษาสมบัติเชิงกลของโมเลกุล โดยมีความสัมพันธ์ที่เป็นหัวใจของการวัดคือความสัมพันธ์ ระหว่างแรงและการยืดตัวของโมเลกุล (Force-Extension Curve:FEC) ซึ่งทำให้เข้าใจโครงสร้างภายในหรือการเปลี่ยนแปลงที่มีผลต่อสมบัติเชิงกลเหล่านี้ได้ โดยเทคนิคต่าง ๆ จะมีช่วงการวัดที่แตกต่างกันไปดังแสดงในตาราง สิ่งที่พึงพิจารณาคือขนาดของแรงที่สนใจศึกษาและขนาดของระบบที่ต้องการวัดเพื่อให้สามารถเลือกใช้เทคนิคที่เหมาะสมกับระบบที่ต้องการได้
| AFM | LOTs | MTs | BFP | |
|---|---|---|---|---|
| Force resolution | 20 pN – 10 nN | 0.1-100 pN | .01-10 pN | pN |
| Stiffness | 10-1000 pN/nm | น้อยกว่า AFM 10 2 − 10 4 {\displaystyle 10^{2}-10^{4}} เท่า | 10 − 4 {\displaystyle 10^{-4}} pN/nm | 0.1-1 pN/nm |
Atomic-Force Microscopy (AFM) เป็นเครื่องมือที่พัฒนาจาก Scanning Tunneling Microscope (STM) ซึ่งเป็นเครื่องถ่ายภาพความละเอียดระดับอังสตรอมด้วย quantum tunneling effect ในขณะที่ AFM ใช้หลักการเชิงกลของเข็มวัดขนาดจิ๋ว (tip) ที่ยึดติดกับคาน (cantilever) เคลื่อนไปตามพื้นผิวของวัสดุทำให้สามารถรับรู้ถึงสภาพพื้นผิวของวัสดุได้โดยแบ่งรูปแบบการทำงานออกเป็น
นอกจากการสร้างภาพพื้นผิวของตัวอย่างแล้ว AFM ใช้ใน SMEs โดยการเคลือบผิวเข็มวัดด้วยสารที่สามารถจับกับโมเลกุลที่ต้องการศึกษา แล้วนำโมเลกุลที่ต้องการศึกษาไปยึดติดไว้กับผิวรองรับ (substrate) เราสามารถนำเข็มวัดนี้ดึงโมเลกุลที่สนใจออกทีละโมเลกุลทำให้ได้ FEC ออกมาตามต้องการ โดยข้อดีของ AFM คือ มีช่วงในการวัดที่กว้างและมีประสิทธิภาพสูง อย่างไรก็ตามยังมีข้อจำกัดจากปัจจัยบางประการคือ
ซึ่งได้มีการใช้ Single-molecule marker และเทคนิค functionalization เพื่อแก้ไขข้อจำกัดเหล่านี้ได้ แต่ข้อจำกัดเกี่ยวกับความละเอียดของการวัดแรงและการกระจัด จะเกิดจาก thermal fluctuation เป็นสำคัญ ซึ่งทำให้ AFM ไม่สามารถวัดแรงที่มีค่าน้อยได้ดีนัก (S/N มีค่าต่ำสำหรับ weak interaction) เราจึงนิยมใช้ AFM ในการศึกษาพันธะที่มีความแข็งแรงสูงถึงพันธะโควาเลนต์ ทั้งภายในและระหว่างโมเลกุล โดยเฉพาะ pulling experiment ในชีวโพลิเมอร์เช่น คาร์โบไฮเดรต โปรตีน และกรดนิวคลีอิก
Laser Optical Tweezers (LOTs) อาศัยหลักการของวัตถุที่มีดัชนีหักเหสูงกว่าสิ่งแวดล้อม จะทำให้เกิดการหักเหของแสงในทิศทางที่จะทำให้เกิดแรงขึ้นได้หากวัตถุนั้นไม่อยู่ในตำแหน่งที่เหมาะสม คล้ายมีสปริงมายึดวัตถุนั้นไว้ให้อยู่ในบริเวณที่ต้องการ Ashkin เป็นผู้ค้นพบปรากฏการณ์นี้ในปี 1970 และทำการยึดจับอนุภาคไดอิเล็กทริกไว้ได้ด้วยลำแสง และต่อมาได้มีการพัฒนาขึ้นเป็นลำดับโดยสามารถจับอะตอมที่ไม่มีประจุ ไวรัส และเซลล์ของสัตว์ชั้นสูงได้ในที่สุด
สำหรับการทดลอง LOTs จะใช้ Near IR LASER เป็นต้นกำเนิดแสงและใช้เม็ดพลาสติกโพลิสไตรีนหรือซิลิกาเป็นวัสดุหักเหแสงโดยมักจะใช้ความเข้มแสงให้ต่ำที่สุด เพื่อลดผลจากความร้อนที่อาจทำลายวัสดุหักเหแสงหรือตัวอย่างได้ ทั้งนี้เราอาจประมาณศักย์ของระบบได้เป็นแบบฮาร์มอนิค ซึ่งสามารถใช้สมการกฎของฮุค F = kx ได้เช่นเดียวกับในกรณีของ AFM อย่างไรก็ตามด้วยค่าความแข็ง (stiffness) ที่น้อยกว่า AFM 102-104 เท่า ทำให้ความละเอียดในการวัดแรงและระยะทางเพิ่มขึ้นอย่างมาก เราสามารถติดตามการเคลื่อนไหวของโมเลกุลที่สนใจด้วยกล้อง CCD หรือสำหรับในระบบที่ซับซ้อนมีการใช้สำแสงอ้างอิง และอาจใช้เสียง (แรงสั่นสะเทือน) ช่วยเพิ่มความแม่นยำในการติดตามโมเลกุลได้ตัวอย่างระบบการวัดด้วย LOTs อาศัยเม็ดวัสดุสองเม็ด ที่เคลือบด้วยสารต่างชนิดกัน เม็ดหนึ่งถูกจับไว้ด้วยแสง (optical trap) อีกเม็ดหนึ่งถูกดูดไว้ด้วยระบบสุญญากาศ โมเลกุลที่สนใจจะถูกติดฉลากที่ต่างกันไว้ ทำให้แต่ละด้านเข้าไปติดกับเม็ดวัสดุแต่ละอันได้อย่างถูกต้องด้วยการจับอย่างจำเพาะ (specific interaction, lock and key, antigen-antibody) ตัวอย่างคือ biotin จับกับ streptavidin หรือ avidin และ digoxigenin จับกับ anti-dig เป็นต้น เมื่อยึดตรึงโมเลกุลไว้เรียบร้อยแล้วก็สามารถทำการดึงโมเลกุลและวัดแรงได้ FEC ออกมา ระบบที่นิยมใช้ LOTs ในการวัดได้แก่กรดนิวคลีอิกและมอเตอร์โมเลกุล
Magnetic tweezers (MTs) ทำงานด้วยหลักการคล้ายกับ LOTs เม็ดวัสดุแม่เหล็กจะถูกยึดอยู่ภายใต้บ่อศักย์อันเกิดจากสนามแม่เหล็ก โดยการทดลองนี้ให้ปลายข้างหนึ่งของโมเลกุลยึดกับเม็ดวัสดุแม่เหล็กและปลายอีกข้างยึดกับผิวแก้ว ทำการเคลื่อนไหวโมเลกุลโดยขยับสนามแม่เหล็กภายนอกส่งผลให้เม็ดวัสดุแม่เหล็กดึงโมโลกุลให้ขยับตามไป แล้วใช้กล้อง CCD ในการติดตามเม็ดวัสดุ ข้อดีของ MTs มีหลายประการดังนี้
ด้วยข้อดีเหล่านี้ จึงทำให้ MTs มักใช้ในการศึกษาสมบัติยืดหยุ่นและการหมุน (elastic and torsional properties) ของ DNA ซึ่งมีขนาดของแรงน้อยมากและเกี่ยวข้องกับการบิดหมุนของโมเลกุล
Biomembrane Force Probe (BFP) มักใช้ในการศึกษาผลของการยึดจับระหว่าง ligand-receptor โดยมีเซลล์เม็ดเลือดแดงช่วยทำหน้าที่เป็นสปริงในระบบ และเอาโมเลกุลที่สนใจศึกษาเคลือบไว้บนเม็ดวัสดุ โดยทั้งสองข้างของระบบจะถูกดูดไว้ด้วยปิเปตแล้วจะถูกดึงออกจากันอย่างช้า ๆ โดยความดันภายในเซลล์เม็ดเลือดแดงจะเป็นตัวกำหนดแรงตึงของผิวเซลล์และค่าความแข็งของสปริง เราสามารถติดตามปรากฏการณ์ที่เกิดขึ้นได้ด้วยกล้อง CCD เช่นเดียวกับการทดลองอื่น ๆ
เมนูนำทาง
การทดลองเชิงโมเลกุลเดี่ยวใกล้เคียง
แหล่งที่มา
WikiPedia: การทดลองเชิงโมเลกุลเดี่ยว