เทคนิควัดการเรืองแสงของโมเลกุลเดี่ยว (Single-molecule fluorescence: SMF) เป็นเทคนิคที่แตกต่างจากวิธีที่กล่าวมาข้างต้นโดยสิ้นเชิง อาศัยหลักการเมื่อโฟตอนหรือแสงตกกระทบโมเลกุล และโมเลกุลดูดกลืนไว้ จะทำการให้เกิดการเปลี่ยนแปลงไปสู่สถานะกระตุ้นและต้องคายพลังงานออกมาผ่านกระบวนการต่าง ๆ หนึ่งในกระบวนการที่เกิดขึ้นได้คือการเรืองแสง โดยจะต้องมีส่วนของโมเลกุลที่ทำให้เกิดการเรืองแสงเรียกว่า fluorophore ทั้งนี้สำหรับ SME การเรืองแสงที่เกิดขึ้นต้องเกิดจากหนึ่งโมเลกุลเท่านั้น จึงต้องทำในสารละลายที่เจือจางมาก และแสงที่เกิดขึ้นก็มีความเข้มต่ำมากต้องใช้เครื่องมือวัดที่ละเอียดเป็นพิเศษ ข้อดีที่สำคัญคือ เทคนิคนี้มีความละเอียดในเชิงเวลา (time resolution) สูง และทำการวัดได้โดยไม่ทำลายเซลล์ (noninvasive) ซึ่งทำให้สามารถทำการศึกษาระบบทางชีววิทยาอย่างที่เรียกว่า in vivo ได้

ทั้งนี้ข้อจำกัดสำคัญของการวัดระยะ (spatial resolution) คือ การกระเจิงของแสงของRayleigh ซึ่งสามารถแก้ไขได้โดยเทคนิค FIONA และ TIRF ด้วยวิธีเหล่านี้ทำให้เราสามารถพิสูจน์ลักษณะการเดินของ myosin V เดินบนเส้นใย actin ได้

นอกจากนี้แล้วยังมีอีกเทคนิคที่สำคัญอย่างยิ่งคือ Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ซึ่งค้นพบโดย Förster ซึ่งเป็นการถ่ายทอดพลังงานระหว่างหมู่ที่ดูดกลืนแสงและถ่ายทอดพลังงาน (donor) และหมู่ที่รับพลังงานและเรืองแสง (acceptor) ภายในโมเลกุลเดียวกัน ซึ่งความเข้มของการเรืองแสงจะเป็นตัวบ่งบอกระยะทางระหว่างหมู่ทั้งสองนี้ จึงเป็นประโยชน์อย่างมากในการติดตามระยะทางระหว่างสองจุดในโมเลกุลที่สนใจขณะเกิดการเปลี่ยนแปลง

ปัญหาสำคัญของ SMF คือการแทรก fluorophore เข้าไปในโมเลกุล ซึ่งต้องทดลองไปเรื่อย ๆ จนกว่าจะพบวิธีการที่เหมาะสมโดยเฉพาะ FRET ต้องแทรกเข้าไปถึงสองตำแหน่งและต้องหา dipolar orientation ของ fluorophore (แก้ไขโดยใช้เทคนิคอื่นเข้าช่วย เช่น EM และ XRD) นอกจากนี้แล้วยังมีปัญหา photobleaching อันเกิดจาก fluorophore ที่ไม่เสถียรทำปฏิกิริยาเคมีแล้วสูญเสียความสามารถในการเรืองแสงไป

อย่างไรก็ตาม SMF ก็มักจะใช้ในการศึกษาการขนส่งโมเลกุล การพับตัวของโปรตีน และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างใน enzymatic reaction ซึ่งเมื่อใช้ร่วมกับเทคนิคที่วัดแรงก็จะทำให้ได้ข้อมูลที่แม่นยำเกี่ยวกับการทำงานของชีวโมเลกุล

ในอดีตเราอาจจำแนกประเภทของการวัดออกเป็น การสังเกตโดยตรงปราศจากเครื่องมือวัดการวัดโดยใช้เครื่องมือวัด ทั้งทางตรงและทางอ้อม หรือการวัดที่อาศัยโฟตอนหรือแสง อาศัยหลักการทางไฟฟ้า อาศัยหลักการเชิงกล ซึ่งก็เป็นแง่มุมที่แตกต่างกันไปสำหรับหลักการในการวัด แต่ในปัจจุบันเมื่อเราได้ให้ความสนใจส่วนใหญ่ไปกับการทำงานระดับโมเลกุล การวัดเชิงโมเลกุลเดี่ยวจึงเป็นอีกแง่มุมของการทดลองที่ได้รับความสนใจเป็นอย่างมาก