แบคทีเรียถูกค้นพบเป็นครั้งแรกโดย แอนโทนี แวน ลีเวนฮุค ในปี 1676 (พ.ศ. 2219) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลนส์เดียวที่เขาออกแบบเองส่องจนพบ เขาได้รับการยกย่องว่าเป็นนักจุลชีววิทยาคนแรกของโลก

สาขาวิชาแบคทีเรียวิทยา ซึ่งภายหลังได้เป็นสาขาย่อยในจุลชีววิทยา ได้ริเริ่มโดย เฟอร์ดินานด์ โคห์น นักพฤกษศาสตร์ผู้ซึ่งศึกษาสาหร่ายและแบคทีเรียที่สังเคราะห์แสงได้ จากการศึกษาของเขาทำให้ทราบเกี่ยวกับแบคทีเรียหลายชนิด และเฟอร์ดินานด์ โคห์น ยังเป็นคนแรกที่วางแบบแผนการจัดหมวดหมู่แบคทีเรียตามหลักอนุกรมวิธาน

หลุยส์ ปาสเตอร์ และโรเบิร์ต คอค เป็นผู้ที่มีชีวิตอยู่ในยุคสมัยเดียวกับโคห์น และถือได้ว่าเป็นผู้ริเริ่มสาขาวิชาจุลชีววิทยาทางการแพทย์ หลุยส์ ปาสเตอร์เป็นที่รู้จักมากที่สุดจากการทดลองเพื่อพิสูจน์หักล้างทฤษฎีสิ่งมีชีวิตเกิดจากสิ่งไม่มีชีวิต ซึ่งทำให้จุลชีววิทยาได้รับการยอมรับว่าเป็นสาขาหนึ่งในวิทยาศาสตร์ชีวภาพ ปาสเตอร์ยังได้ออกแบบวิธีการถนอมอาหารโดยการพาสเจอร์ไรซ์ และคิดค้นวัคซีนป้องกันโรคต่างๆอย่างเช่นโรคแอนแทรกซ์ อหิวาตกโรคจากสัตว์ปีก และโรคพิษสุนัขบ้า ส่วนโรเบิร์ต คอค มีชื่อเสียงจากการสนับสนุนทฤษฎีการเกิดโรค ซึ่งพิสูจน์ว่าโรคชนิดใดๆจะเกิดจากเชื้อจุลินทรีย์เฉพาะที่ก่อโรคนั้นๆเท่านั้น ต่อมาทฤษฎีนี้เป็นที่รู้จักกันในชื่อว่า สมมติฐานของคอค และคอคยังเป็นหนึ่งในนักวิทยาศาสตร์ที่มุ่งศึกษาการแยกตัวของแบคทีเรียในการทำเชื้อให้บริสุทธิ์ ซึ่งทำให้เขาค้นพบเชื้อแบคทีเรียชนิดใหม่ๆ มากมาย เช่น เชื้อ Mycobacterium tuberculosis ที่เป็นสาเหตุของวัณโรค

แม้ว่าโดยทั่วไปมักจะถือว่า หลุยส์ ปาสเตอร์ และโรเบิร์ต คอค เป็นผู้ริเริ่มสาขาจุลชีววิทยา แต่ผลงานของพวกเขาก็ยังไม่สามารถอธิบายความแตกต่างของจุลินทรีย์ชนิดต่างๆ ได้อย่างถูกต้องนัก เพราะพวกเขามุ่งศึกษาเฉพาะจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับการแพทย์เท่านั้น ผู้ที่ถือได้ว่าริเริ่มสาขาวิชาจุลชีววิทยาทั่วไปอย่างแท้จริง คือ มาร์ตินุส ไบเจอริงค์ และเซลเก ไวโนแกลดสกี พวกเขาได้ทำให้ขอบเขตการศึกษาจุลชีววิทยากว้างขวางออกไป ไบเจอริงค์มีผลงานสำคัญทางด้านจุลชีววิทยา 2 ผลงาน คือ การค้นพบไวรัส และการพัฒนาวิธีเพาะเชื้อแบบเอนริช ผลงานการศึกษาไวรัสโรคลายด่างในยาสูบของเขาได้เป็นรากฐานของสาขาไวรัสวิทยา และการเพาะเชื้อแบบเอนริชมีบทบาทสำคัญต่อวงการจุลชีววิทยา โดยทำให้สามารถเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ที่ยังไม่เคยเพาะเลี้ยงได้ ส่วนไวโนแกลดสกี เป็นคนแรกที่คิดค้นแนวคิดเกี่ยวกับเคมีของดิน ซึ่งแสดงให้เห็นกิจกรรมของจุลินทรีย์ในดินที่เป็นกระบวนการทางเคมี และทำให้เขาค้นพบแบคทีเรียที่สามารถตรึงไนโตรเจนจากอากาศได้